ライブ顕微鏡イメージング下での3Dヒドロゲルの制御株

要約

提示された方法は、ライブ共焦点顕微鏡を可能にしながら、シリコーンゴムに埋め込まれた3Dソフトヒドロゲルの単軸ストレッチを含む。繊維のアライメントと同様に、外部および内部ヒドロゲル株の特性評価が実証されている。開発された装置およびプロトコルはさまざまなひずみのレジームに対する細胞の応答を査定できる。

要約

外力は組織形成、発達、維持において重要な要素です。これらの力の効果は、多くの場合、特殊なin vitroストレッチ法を使用して研究されます。様々な利用可能なシステムは、ソフトハイドロゲルを歪める3D技術のアクセシビリティながら、2D基板ベースのストレッチャーを使用し、より制限されています。ここでは、サンプルキャリアとして弾性シリコーンストリップを用いて、その周囲から軟質ヒドロゲルの外部ストレッチを可能にする方法について説明する。このプロトコルで利用される伸張システムは3Dプリント部品と低コストのエレクトロニクスから構成され、他のラボで簡単かつ容易に複製できます。実験プロセスは、シリコーンストリップの中心での切り抜きに厚い(>100 μm)ソフトフィブリンヒドロゲル(約100 Paの弾性率)を重合することで始まります。シリコーンゲルの構造は、印刷された伸張装置に取り付けられ、共焦点顕微鏡の段階に置かれる。ライブ顕微鏡では、ストレッチデバイスが活性化され、ゲルは様々なストレッチマグニチュードで画像化されます。その後、画像処理を使用して得られたゲル変形を定量化し、ゲルの3D厚さ(Z軸)全体で比較的均質な歪みと繊維のアライメントを実証します。この方法の利点は、その場合の顕微鏡で実行しながら、3Dで非常に柔らかいヒドロゲルを歪める能力、およびユーザーのニーズに応じてサンプルの形状とサイズを操作する自由が含まれます。さらに、適切な適応により、この方法は、他のタイプのヒドロゲル(例えば、コラーゲン、ポリアクリルアミドまたはポリエチレングリコール)を伸ばすために使用することができ、よりバイオミメティックな3D条件下での外力に対する細胞および組織応答の分析を可能にすることができる。

概要

機械的な力に対する組織応答は、遺伝子発現^1、細胞分化^2、および組織改修³を含む幅広い生物学的機能の不可欠な部分である。また、繊維アライメントや高密度化などの細胞外マトリックス(ECM)における力誘発変化は、細胞の挙動および組織形成^4、5、6に影響を及ぼす可能性がある。ECMの繊維状メッシュ構造は、非線形弾性、非アフィン変形、塑性変形^{7、8、9、10、11、12}などの興味深い機械的特性を有する。これらの特性は、細胞とその周囲の微小環境が外部の機械的力^13,14に応答する方法^に影響を与^える。ECMと組織....

プロトコル

1. 溶液準備(事前に実施)

1. フィブリノーゲンラベリング
   注: ラベル付け手順は、フィブリンゲルの変形を解析する場合にのみ必要です。細胞実験のために、標識されていないゲルを使用することができる。
   1. 10 mg/mL スクシニミジルエステル蛍光色素(DMSOに溶解)の38 μLを、15 mg/mLフィブリノーゲン溶液(モル比5:1)を50mL遠心チューブに加え、室温で1時間シェーカーに置きます。その後、チューブを遠心分離機に3分間、800 x g( 室温)で入れます。
   2. 前工程から上清を濾過し、デキストランゲル樹脂(材料表)を詰めた脱塩カラムを通して、未反応染料を分離し^、42 を以下のステップに従って分離する。
      1. フィブリノーゲンバッファーの25 mLでカラムを事前洗浄してください。
      2. ステップ1.1.1から標識フィブリノーゲンをゆっくりと列に注入し、フィルターに入る気泡がないことを確認します。溶出した溶液の最初の〜0.3mL(かすかな着色された液体の4〜6滴)を捨てます。次に、精製溶液の次の1.0〜1.5 mLを収集します(より具体的な詳細については、メーカーのプロトコルに従ってください)。
      3. シリンジ駆動フィルター(0.22-0.45 μm)を使用して得られた精製溶液を殺菌して、濾過プロセスを完了します。
      ....

結果

3Dフィブリンヒドロゲルを運ぶシリコーンストリップに適用される大きさの増加の静的ストレッチからの代表的なデータは、1μmの蛍光ビーズで埋め込まれた、図9に示されている。この分析は、シリコンストレッチが切り抜きの幾何学的変化およびゲル内で発達した株に及ぼす影響を示しています。ゲル全体のZ-スタック画像を使用して、元の円形状の切り?.......

ディスカッション

本明細書に提示される方法とプロトコルは、主にRoitblat Ribaらの以前の研究に基づいており^、41 ここに SCyUS デバイスの完全なコンピュータ支援設計(CAD)、Pythonおよびマイクロコントローラコードが含まれています。

既存のアプローチよりも提示された方法の主な利点は、非常に柔らかい3Dヒドロゲル(〜100 Paの弾性率)をその円周から、 およびラ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)	Biological Industries	01-052-1A	Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5	Bar-Naor Ltd.	BN72204-30	22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO	Sigma-Aldrich Inc.	D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Biological Industries	02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)	Omrix Biopharmaceuticals	3902	Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer	N/A		Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)	Invitrogen	F8820	Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber	McMaster-Carr	3788T41	580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)	GE Healthcare	17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound	Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.	HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39	National Institute of Health, Bethesda, MD	Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)	Arduino/Adafruit	Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge	Thermo Scientific	75002470
Parafilm	Bemis	PM-996
Primovert Light Microscope	Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.	491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)	Dassault Systèmes	N/A
SCyUS Code37	N/A	N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010	Adafruit	155
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030	For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates	Corning	430167
Thrombin buffer	N/A		Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)	N/A	N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope	Carl Zeiss AG	2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)	Carl Zeiss AG	Release Version 14.0.0.0