Контролируемое напряжение 3D-гидрогелей при визуализации живой микроскопии

Резюме

Представленный способ включает одноосное растяжение 3D мягких гидрогелей, встроенных в силиконовую резину, при этом позволяя проводить живую конфокальную микроскопию. Показано определение характеристик внешних и внутренних деформаций гидрогеля, а также выравнивание волокон. Разработанное устройство и протокол могут оценивать реакцию клеток на различные режимы деформации.

Аннотация

Внешние силы являются важным фактором в формировании, развитии и поддержании тканей. Воздействие этих сил часто изучается с использованием специализированных методов растяжения in vitro. Различные доступные системы используют носилки на основе 2D-подложки, в то время как доступность 3D-методов для деформации мягких гидрогелей более ограничена. Здесь мы описываем метод, который позволяет внешне растягивать мягкие гидрогели от их окружности, используя упругую силиконовую полосу в качестве носителя образца. Система растяжения, используемая в этом протоколе, построена из 3D-печатных деталей и недорогой электроники, что делает ее простой и легкой для воспроизведения в других лабораториях. Экспериментальный процесс начинается с полимеризации толстых (>100 мкм) мягких гидрогелей фибрина (модуль упругости ~100 Па) в вырезе в центре силиконовой полосы. Силикон-гелевые конструкции затем прикрепляются к печатно-растягивающей устройству и помещаются на ступень конфокального микроскопа. При живой микроскопии активируется растягивающее устройство, и гели визуаизируются с различной величиной растяжения. Затем обработка изображений используется для количественной оценки результирующих деформаций геля, демонстрируя относительно однородные деформации и выравнивание волокон по всей толщине геля 3D (осьZ). Преимущества этого метода включают в себя возможность деформации чрезвычайно мягких гидрогелей в 3D при выполнении микроскопии in situ и свободу манипулировать геометрией и размером образца в соответствии с потребностями пользователя. Кроме того, при правильной адаптации этот метод может быть использован для растяжения других типов гидрогелей (например, коллагена, полиакриламида или полиэтиленгликоля) и может позволить анализировать реакцию клеток и тканей на внешние силы в более биомиметических 3D-условиях.

Введение

Реакция тканей на механические силы является неотъемлемой частью широкого спектра биологических функций, включая экспрессию генов^1,дифференцировку клеток²и ремоделирование^{тканей 3.} Кроме того, вызванные силой изменения во внеклеточном матриксе (ECM), такие как выравнивание и уплотнение волокон, могут влиять на поведение клеток и формирование тканей^4,5,6. Структура волокнистой сетки ECM обладает интригующими механическими свойствами, такими как нелинейная упругость, неаффинная деформация и пластические деформации^{7,8,9,10,11,12.} Эти свойства влияют на то, как клетки и окружающая их микросреда реагируют на внешние механические силы^13,14. Понимание того, как ECM и ткани реагируют на механические силы, позволит прогрессировать в области тканевой инженерии и в разработке более точных вычислительных и теоретических моделей.

Наиболее распространенные методы механического растяжения образцов были сосредоточены на 2D-субстратах, нагруженных клетками, чтобы изучить влияние на поведение клеток. К ним относятся, например, нанесение деформации на подложки из полидиметилсилоксана (PDMS) и анализ углов переориентации клеток по отношению к направлению растяжения^{15,16,17,18,19.} Тем не менее, методы, исследующие реакцию 3D-гидрогелей, встроенных в клетки, на внешнее растяжение, ситуацию, которая более точно имитирует микроокружение тканей, более ограничены. Достижения в области методов 3D-растяжения имеют особое значение, потому что клетки ведут себя по-разному на 2D-подложках по сравнению с 3D-матрицами^20. Это поведение включает клеточную перестройку, уровни экспрессии белка и модели миграции^21,22,23.

Методы и устройства, позволяющие растягивать 3D-образец, включают как коммерчески доступные^{24,25,26,27,28,} так и разработанные для лабораторных исследований^29. В этих методах используются рассываемые силиконовые трубки^30,многозаборные камеры^31,зажимы^26,32,биореакторы^11,33,консольные^{камеры 34,35,36}и магниты^37,38. Некоторые методы генерируют растяжение, которое локально деформирует 3D-гидрогели, например, путем вытягивания игл из двух отдельных точек в^{геле 5,}в то время как другие допускают деформацию всей массы геля^16. Более того, большинство из этих систем сосредоточены на анализе поля деформации в плоскости X-Y, с ограниченной информацией о поле деформации в Z-направлении. Кроме того, только несколько из этих устройств способны к микроскопической визуализации in situ. Основной проблемой визуализации in situ с высоким увеличением (например, конфокального микроскопа) является ограниченное рабочее расстояние в несколько сотен микрон от объектива до образца. Устройства, которые действительно позволяют визуализировать в реальном времени во время растяжения, жертвуют однородностью деформации в оси Zили относительно сложны и трудно воспроизводятся в других лабораториях^39,40.

Такой подход к растяжению 3D-гидрогелей позволяет проводить статическую или циклическую одноосную деформацию во время живой конфокальной микроскопии. Растягивающее устройство (называемое «Smart Cyclic Uniaxial Stretcher — SCyUS») построено с использованием 3D-печатных деталей и недорогого оборудования, что позволяет легко воспроизводить в других лабораториях. К устройству прилагается коммерчески доступная силиконовая резина с геометрическим вырезом в центре. Компоненты гидрогеля полимеризуются для заполнения выреза. Во время полимеризации биологические гидрогели, такие как фибрин или коллаген, естественным образом прилипают к внутренним стенкам выреза. Используя SCyUS, силиконовая полоса ненатягивается, передавая контролируемые деформации во встроенный 3D-гидрогель^41.

Эта система позволяет обеспечить уникальное сочетание функций и преимуществ по сравнению с другими существующими методами. Во-первых, система позволяет одноосное растяжение толстых 3D-мягких гидрогелей (толщиной >100 мкм, жесткость <1 кПа) с их периферии с Z-однороднойдеформацией по всему гидрогелю. Эти гидрогели слишком мягкие, чтобы их можно было сжимать и растягивать обычными методами растяжения. Во-вторых, растягивающее устройство может быть легко воспроизведено в других лабораториях, поскольку 3D-печать легко доступна для исследователей, а электроника, используемая в дизайне, является недорогой. В-третьих, и, возможно, самая привлекательная особенность, геометрия и размер выреза в силиконовой полосе могут быть легко обработаны, что позволяет настраивать градиенты деформации и граничные условия, а также использовать различные объемы образцов, вплоть до нескольких микролитров.

Представленный протокол состоит из формования фибринового геля в диски диаметром ~2 мм в силиконовых резиновых полосах толщиной 0,5 мм, продолженных одноосным растяжением под живой конфокальной микроскопией. Далее подробно обсуждаются экспериментальные процедуры измерения и анализа деформаций, действующих на геометрический вырез, внутренние деформации, выработанные в гидрогеле, а также результирующее выравнивание волокон после различных манипуляций с растяжением. Наконец, обсуждается возможность встраивания клеток в гидрогель и воздействия на них контролируемого внешнего растяжения.

протокол

1. Подготовка раствора (производится заранее)

1. Маркировка фибриногена
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этап маркировки требуется только в том случае, если требуется анализ деформации фибринового геля. Для клеточных экспериментов можно использовать немеченый гель.
   1. Добавьте 38 мкл 10 мг/мл флуоресцентного красителя сукцинимидилового эфира (растворенного в ДМСО) в 1,5 мл раствора фибриногена 15 мг/мл (молярное соотношение 5:1) в центрифужную трубку 50 мл и поместите на шейкер на 1 час при комнатной температуре. После этого поместите трубку в центрифугу на 3 минуты при 800 х г (комнатная температура).
   2. Фильтруйте супернатант с предыдущей ступени через обессоливую колонну, заполненную декстрановой гелевой смолой(Таблица материалов), чтобыотделить нереактированный краситель,^42, выполнив следующие шаги.
      1. Предварительно промыть колонну 25 мл фибриногенного буфера.
      2. Медленно вводите меченый фибриноген с шага 1.1.1 в колонку, следя за тем, чтобы в фильтр не поступали пузырьки. Отбросьте первые ~0,3 мл элюированного раствора (4-6 капель слабой окрашенной жидкости). Затем собирают следующие 1,0-1,5 мл очищенного раствора (следуйте протоколу производителя для получения более конкретных деталей).
      3. Завершите процесс фильтрации стерилизацией полученного очищенного раствора с помощью шприцевого фильтра (0,22-0,45 мкм).
      4. Для очистки и переработки колонны промыть 20 мл фибриногенного буфера, а затем хранить в 25 мл 20% этанола.
2. После элюирования разделите полученный очищенный меченый фибриноген на небольшие аликвоты ~7-50 мкл в зависимости от желаемого количества растянутых гелей. Для каждого растянутого геля круга диаметром 2 мм приготовьте около 3,5 мкл фибриногена (на гель будет использоваться 2,5 мкл + 1 мкл для ошибок пипетирования).
   1. Храните аликвоты в морозильной камере при -20 °C. Их можно использовать примерно до одного года (не рекомендуется размораживать и снова замораживать).
   2. В течение остальной части этого протокола храните приблизительно 7 мкл очищенного меченого фибриногена в холодильнике (4 °C) до этапа 4. Этот объем предназначен для создания двух растянутых гелей (на гель необходимо 2,5 мкл, а для учета ошибок в пробоподготовке используется дополнительный объем в 1 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура фильтрации обычно разбавляет исходный раствор фибриногена 15 мг/мл до конечной концентрации около 10 мг/мл. Коэффициент разбавления зависит от исходного объема и концентрации фибриногена, как указано в протоколе производителя.
3. Приготовить 7 мкл тромбиновой раствора (разбавить с помощью тромбинового буфера до 2 ед/мл, Таблица материалов)и держать в холодильнике (4 °С) до этапа 4. Этот объем предназначен для заполнения вырезов двух растянутых гелей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения анализа внутренней деформации к флуоресцентным сферическим шарикам диаметром 1 мкм (приобретаемые в виде суспензии [2% твердых веществ] в воде плюс 2 мМ NaN₃₎следует добавить к раствору тромбина (для 40-кратного объектива рекомендуется соотношение 1:25 в/об% от бисера:тромбин). Бусины следует включать только тогда, когда требуется измерение внутренней деформации, либо при наличии, либо при отсутствии клеток.

2. Подготовка силиконовой полосы

1. Извлеките силиконовую резину толщиной 0,5 мм и разрежьте ее на полосы размером 15 x 80 мм² с отверстием диаметром 2 мм в центре полосы(рисунок 1). Если возможно, используйте программируемый лазерный резак для высокой точности. Если программируемое оборудование недоступно, ножниц достаточно для резки контура полосы, а для центрального выреза достаточно небольшого отверстия-перфоратора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коммерческая силиконовая резина обычно приобретается с пластиковой пленкой с обеих сторон. Держите оригинальное пластиковое покрытие с обеих сторон силикона, если это возможно. При повторном замыкание силиконовых полосок из предыдущего эксперимента обработайте их трипсином в течение 0,5 ч, замочите в 0,2 М NaOH на 0,5 часа, а затем замочите в 70% этаноле на 1 час. Дайте им высохнуть перед использованием.
2. Подготовьте слои герметизирующих (гидрофобных) слоев размерами не менее 20 ×^{30 мм2,}чтобы они были шире силиконовой полосы и тем самым позволяли образовывать уплотнение над всем геометрическим вырезом.
3. Вымойте 10-сантиметровую посуду с 70% этанолом, а затем протрите и высушите необлицовочные деликатные салфетки (как для стерильных, так и для нестерильных экспериментов). Этот шаг важен, поскольку он позволяет слоям герметизирующих пленок лучше прилипать к пластине и ограничивать движение образца в процессе подготовки.
4. Поместите слои герметизируемой пленки в вымытую посуду 10 см, чтобы было достаточно места для размещения двух полосок в каждой посуде бок о бок(рисунок 2A).
   1. Снимите полиэтиленовую пленку с одной стороны силиконовой полосы и поместите открытую сторону на слой уплотнительной пленки, чтобы вырез был полностью окружен слоем уплотнительной пленки(рисунок 2B). Затем осторожно надавите на силикон на слой уплотнительной пленки, чтобы запечатать область, окружающую вырез, используя чистые пальцы в перчатках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между силиконом и уплотнительной пленкой нет воздушных карманов, особенно вокруг выреза. Сделайте это, осмотрев нижнюю сторону блюда(рисунок 2C).

Рисунок 1: Подход к деформации гидрогеля. (A)15 × 80 мм² силиконовая полоса с вырезом диаметром 2 мм в центре полосы(B)Силиконовая полоса с круглым вырезом со встроенным фибриновым гелем. Для иллюстративных целей вырез в силиконе больше, чем в реальных экспериментах(C)Схема растяжения с силиконовой полосой (оранжевый), круглым гелем (вырез посередине) и удлинителями ткани (зеленый), которые соединяют силикон с растягивающим устройством. Увеличенная площадь геля указывает на деформацию геля, в ответ на одноосное растяжение силикона. Для простоты сжатие по толщине геля (осиZ)на рисунке не показано. Рисунки 1B & 1C были адаптированы из Roitblat Riba et al.⁴¹Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Пример правильного размещения силиконовой полосы на уплотнительной пленке перед полимеризацией геля. (A)Размещение двух слоев герметизирующих пленок в тарелке размером 10 см (B)Размещение силиконовых полос на слоях уплотнительной пленки(C)Вид снизу тарелки, отображающий воздушное уплотнение между силиконом и слоем уплотнительной пленки. Слева:Правильное уплотнение слоя уплотнительной пленки к силиконовой полосе вокруг выреза без воздушных карманов. Справа:Неправильное уплотнение слоя уплотнительной пленки к вырезу силиконовой полосы с воздушными карманами по краю выреза. Это приведет к утечке компонентов гидрогеля под силиконом. Красная стрелка указывает на область, где образовался воздушный карман. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

3. Приготовление тромбина с клетками

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот этап только в том случае, если требуется встраивание клеток в гидрогель, и в стерильных условиях в биологическую вытяжку(Таблица материалов).

1. Стерилизация: за день до клеточного эксперимента поместите силиконовые полоски и слои герметизируемой пленки в 70% этанол на ночь, а затем выполните УФ-стерилизацию в течение 30 минут с каждой стороны (если посуда размером 10 см еще не стерильны, они также должны быть стерилизованы под ультрафиолетовым светом в течение 30 минут после промывки 70% этанола). УФ-система, используемая в протоколе, встроена в биологический капот.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, цикл автоклавной стерилизации (140 °C) может быть выполнен на силиконовых полосах, поскольку они устойчивы к 260 °C.
2. Выполняют подсчет клеток для определения концентрации клеток, а затем центрифугируют и повторно суспендируют клеточную гранулу с 7 мкл тромбина (2 единицы / мл) в центрифужной трубке 1,5 мл. Мы рекомендуем клеточную концентрацию 800 клеток/мкл тромбина. Держите клетки охлажденными до использования (не превышайте более получаса, чтобы избежать повреждения клеток).

4. Полимеризация фибриновых гелей

1. Извлеките 2 единицы / мл тромбина и 10 мг / мл меченых растворов фибриногена из холодильника (подготовленных на этапе 1) и поместите их на лед, где они будут доступны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы хранят в холодном месте перед процессом смешивания, чтобы замедлить кинетику реакции полимеризации. Это позволяет более однородно смешивать белки.
2. Когда тарелка (тарелки) установлена (этап 2), извлеките 2,5 мкл меченого фибриногена и пипетку равномерно в силиконовый вырез (с прикрепив слой уплотнительной пленки к его нижней стороне) так, чтобы вся окружность выреза контактировала с фибриногеном. Будьте осторожны, чтобы не позволить каким-либо воздушным карманам или пузырькам образоваться где-либо в растворе, обращая особое внимание на нижние края выреза (интерфейс между слоем уплотнительной пленки и силиконом).
3. Немедленно возьмите 2,5 мкл тромбина (с клетками/шариками или без) и пипетку непосредственно в раствор фибриногена в вырезе (достигнув конечного объема фибрина 5 мкл). Затем быстро перемешайте два раствора, тщательно пипетируя вверх и вниз ~ 10 раз. Во время процесса смешивания перемещайте наконечник по всему объему, чтобы создать как можно более однородный раствор.
4. Добавьте очень небольшое количество фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) [альтернативно клеточная среда для клеточных экспериментов, Таблица материалов]вдоль края каждой чашки, чтобы гидрогель не высох во время процесса полимеризации. Убедитесь, что нет контакта между PBS/клеточной средой и образцами, так как это повредит образец.
5. Накройте посуду (блюда) и поместите их в инкубатор при 37 °C на 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуемое время инкубации зависит от объема геля. Если используются большие объемы, время инкубации должно увеличиться.
6. Выньте тарелку (чашки) из инкубатора и добавьте PBS/клеточную среду в блюдо, погружая всю гелево-силиконовую конструкцию.
7. Осторожно поднимайте образцы конструкций по одному из тарелки, следя за тем, чтобы слой герметизной пленки оставался прилип к полосе. Медленно отсоедините слой уплотнительной пленки от силикона, осторожно перекипав с одного конца силикона на другой(рисунок 3). Избегайте вытягивания из областей, близких к вырезу, где могут существовать концентрации напряжений (это в основном важно для некруглой геометрии). Избегайте любого контакта с вырезом, так как это повредит образец.
8. Поместите полоску обратно в тарелку с PBS/клеточной средой так, чтобы полоска плавал в блюде. Затем отведите чашку (чашки) к стандартному микроскопу клеточной культуры, чтобы качественно оценить состояние каждого образца. Гели должны быть однородными, непрерывными на протяжении всего выреза, и никаких пузырьков не должно присутствовать. Используя рисунок 4 в качестве руководства, выберите лучшие образцы для дальнейшего анализа.

Рисунок 3: Правильное удаление слоя уплотнительной пленки со дна силиконовой полосы. Процесс удаления следует проводить медленно, чтобы гидрогель не порвал и не нарушил свою адгезию с внутренними стенками выреза. Белая стрелка показывает направление удаления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Микроскопическое наблюдение за фибриновыми гелями в силиконовом вырезе. (A) Два примера правильно полимеризованного фибринового геля. Обратите внимание на относительную однородность геля и полную адгезию к краям выреза(B)Два примера отказа от полимеризации образца. Вверху:Обратите внимание на множество пузырьков и агрегатов, образовавшуюся с левой нижней стороны. Внизу:Обратите внимание на разрыв геля с вырезанных краев и заполнителей в нижней левой области выреза. Шкала = 300 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

5. Загрузка образца на устройство SCyUS

1. Наполните ванну средой PBS/ячейки(рисунок 5)и поместите силиконовую полоску, несущую образец геля сверху, чтобы концы сидели по обе стороны ванны. Ванна предназначена для того, чтобы избежать высыхания геля. Поместите и затяните зажимы (фиолетовый) вместе с тканевыми полосками (зеленый) так, чтобы все части соединились в одну прямую полосу с вырезом в центре(рисунок 5).
2. Извлеките устройство SCyUS и прикрепите алюминиевый жидкостный колодец и прямоугольный стеклянный облицовку размером 22 мм x 40 мм (No 1 или 1,5)(рисунок 6Aiii). Прикрепите крышку к дну скважины с помощью уплотнительного материала (например, вакуумной смазки), чтобы скважину можно было заполнить жидкостью без утечки.
   1. Заполните колодец ~1-2 мл PBS/клеточной среды и поместите в устройство полоску + ткань +гель (рисунок 6B). Зажмите тканевую полоску(2)в кронштейн(1)так, чтобы вырез +гель (5)оказался в центре, как показано на рисунке, затем аккуратно поместите зажимную вставку(4)в устройство и зафиксируйте ее на месте.
   2. Затем вставьте другую сторону ткани в шпиндель (без прикрепления серводвигателя) и зафиксируйте его в шпинделье(рисунок 6C).
3. Вставьте прибор SCyUS с прикрепленным образцом в ступень микроскопа(рисунок 6С). Подключите микроконтроллер(Таблица материалов)к компьютеру через USB-кабель и подключите серводвигатель к микроконтроллеру. Откройте модуль управления SCyUS на компьютере. Образец теперь готов к визуализации, чтобы проверить адекватность толщины геля и однородность волокна под конфокальным микроскопом.

Рисунок 5: (A)Джиг, содержащий ванну PBS (напечатанную на 3D-принтере)(B)Размещение полосы на джиге для обеспечения надлежащего линейного крепления кронштейнов (фиолетового цвета) и предотвращения высыхания геля. Этот рисунок был изменен с разрешения Roitblat Riba et al.⁴¹Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Растягивающее устройство SCyUS. (A) Несколько видов модели CAD основных частей SCyUS: шпиндель, соединенный с сервоприводом (синий), статический якорь (красный), вставка, которая прикрепляет силиконовую полосу вниз (фиолетовый) и фиксаторы, которые предотвращают подъем вставки вверх (желто-зеленый). Вид системы сверху(Ai),вид системы (Aii), вид системы(Aii),показывающий путь полосы (оранжевая линия), и вид снизу(Aiii)алюминиевой жидкостной скважины со стеклянным покровом. Жидкостный колодец можно перемещать вверх и вниз поворотом винта, установленного в основной резьбе. Движение алюминиевого колодца вверх ограничено боковыми крыльями фиолетовой вставки, как показано белыми стрелками(B)Фактическая система: ( 1 )статическийанкер (2) зеленый неэластичный тканевый (3) винт для контроля высоты алюминиевой жидкостной скважины (4) красная зажимная вставка (5) силиконовая полоса с круглым вырезом (6) синие соединительные зажимы (C) Система растяжения, размещенная на конфокальном микроскопе. Серводвигатель и шпиндель показаны стрелками. Этот рисунок был изменен с разрешения Roitblat Riba et al.⁴¹Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

6. Обеспечьте достаточное количество геля для отбора проб

1. С помощью конфокального микроскопа(Таблица материалов)берут низкоусилищное (10×) низкое разрешение (~1,4 мкм х 1,4 мкм размер пикселя) конфокальный Z-стек (≤10 Z-срезов с размером шага примерно 10 мкм достаточно) плиточное изображение всего геля с помощью лазеров 488/543/561 для проверки однородности и адгезии к окружности геометрического выреза по всей толщине силикона(рисунок 7A-B). Используйте это изображение Z-стека в качестве карты для следующих шагов.
2. Используя живую визуализацию с низким разрешением, отсканируйте гель и определите самое низкое Z-положение,где полная адгезия к внутренним стенкам выреза очевидна без разрывов или пузырьков, и обратите внимание на Z-расположениемикроскопа(Z_l). Чтобы определить полную адгезию геля к силикону по всей его окружности, под микроскопом сканируют интерфейс флуоресцентной этикетки геля и силиконовой полосы (темный фон)(рисунок 7С).
3. Двигайтесь вверх в направлении Zдо тех пор, пока в геле больше не будет непрерывности, и обратите внимание на положение Z( Z_u):
4. Вычтите верхний предел(Z_u) направления Zиз нижнего предела(Z_l). Это эталонная толщина образца (Z_o):
   
   Если Z_o ≥ 100 мкм, то гель считается удовлетворительным для анализа. Обратите внимание, что толщина силиконового выреза составляет около 500 мкм, но полимеризация геля в вырезе обычно приводит к меньшей толщине геля. 100 мкм - это минимальная рекомендуемая толщина для обеспечения стабильного процесса растяжения, без разрывов или отрыва геля от силиконового выреза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В разных местах XY толщина геля может варьироваться. Этот раздел протокола измеряет минимальную толщину геля, позволяя определить качество геля и указать, достаточно ли его для растяжения. Кроме того, нахождение центра геля обеспечивает ориентир для возврата к пост-растяжению, будь то статическое или динамическое.

Рисунок 7: Однородность геля. Изображения плиток были захвачены и сшиты с использованием программного обеспечения конфокального микроскопа (Таблица материалов) (A) Одно сшитое изображение Z-срезаплитки образца фибринового геля с относительно неоднородной плотностью волокна из-за неправильного смешивания тромбина и фибриногена предварительно полимеризации. Этот гель не обеспечит надежного анализа (B) Одна сшитая плитка Z-срезизображения образца фибринового геля с относительно однородной плотностью волокна. Это приемлемый гель для экспериментов по растяжке. Шкала для изображений A & B составляет 200 мкм (C)Увеличение интерфейса между флуоресцентно меченым гелем (красный) и силиконом (черный фон). Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

7. SCyUS операция, растяжение и визуализация

1. Теперь, когда образец был определен как удовлетворительное качество и установлен на устройстве SCyUS должным образом, определите предварительно растянутое положение образца. Это достигается с помощью живой визуализации под конфокальным микроскопом (аналогично шагу 6.2).
   1. Убедитесь, что серводвигатель находится в нулевом положении, нажав кнопку Go To Zero Servo Pos (Щелкните на рисунке 8A и убедитесь, что на рисунке 8B отображается ноль) и прикрепите его к растягивательному устройству, как показано на рисунке 6C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Делайте этот шаг медленно и осторожно, чтобы не натянуть образец.
   2. Во время визуализации образца перемещайте двигатель на один градус(рисунок 8C)за раз по часовой стрелке, нажимая кнопку +1, пока не будет замечено движение правой стороны выреза. Затем переверните движение назад(рисунок 8D)обратно в положение предпоследнего шага, нажав на кнопку -1. Это подтверждает, что образец находится под минимальным напряжением. Нажмите на кнопку Set Min Servo Position (Рисунок 8E),чтобы установить опорное положение. Вернуться в опорное положение можно в любое время, нажав кнопку Go To Min Servo Position (рисунок 8F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для минимизации ошибок рекомендуется использовать объектив с высоким увеличением (≥40×).
   3. Захват изображения плитки с высоким увеличением (40×) с высоким разрешением (~0,2 мкм × размером пикселя 0,2 мкм) с одним Z-срезом всей области геля. Он будет использоваться в качестве эталонного изображения для анализа постобработки. Рекомендуется захватывать одно Z-срезное изображение в середине толщины геля (с помощью Z_o из экв. 1),это позволит вернуться примерно в то же Z-положениепосле растяжения. Кроме того, учитывайте, что изображения плитки с высоким разрешением всей области геля занимают значительное время (~ 20-30 мин).
   4. Теперь образец готов к статическому растяжению. Отрегулируйте серводвигатель до желаемой величины растяжения, продвигаясь на один градус(рисунок 8C)за раз в графическом интерфейсе (выполняйте это медленно, около 1 градуса в секунду).
2. На каждой величине растяжения, где необходим анализ, захватите одно изображение плитки с высоким разрешением Z-среза всей области геля для анализа после обработки. Подобно шагу 6.2, убедитесь, что гель не отделился от силикона по всей его окружности, путем сканирования интерфейса между гелем (красный) и силиконом (темный фон), ища изменения адгезии от предыдущей величины растяжения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время активации двигателя используйте живую визуализацию, чтобы следить за расположением геля в X-Y (с низким разрешением и низким увеличением). Гель испытывает эффект Z-Пуассона, когда дно геля поднимается, поэтому Z-положениемикроскопа также должно быть скорректировано в соответствии с приблизительным центром толщины геля для каждой величины растяжения. Это может быть достигнуто путем пересчета Z_o (экв. 1)для каждой величины растяжения. Поскольку растяжение в Z-направленииотносительно однородно, не критично найти точную глубину центра геля.

Рисунок 8: Графический интерфейс для модуля управления SCyUS. (A) Положение двигателя в градусах. Значение колеблется от -90° до 90°(B)'Установить минимальное положение сервопривода'. Эта кнопка позволяет установить заданное минимальное положение, для установки нового опорного положения, которое отличается от нулевого положения сервопривода(C)Кнопка «Плюс 1°» перемещает серводвигатель на один градус по часовой стрелке (D) Кнопка «Минус 1°» перемещает серводвигатель на один градус против часовой стрелки(E)Кнопка «Перейти в нулевую позицию» устанавливает положение серводвигателя на 0° ([A] будет установлено на ноль) (F) Кнопка «Перейти к минимальному положению сервопривода» перемещает серводвигатель в определенное пользователем положение «Min». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

8. Постобработка внешних измерений деформации

1. Чтобы измерить эффективные деформации границ выреза, измерьте длины от края до края в направлении растяжения (осьX)в центре оси Y(рисунок 9A).
   1. Загрузите предварительно растягиваемое изображение в программное обеспечение для обработки изображений (ImageJ FIJI⁴³⁾и измерьте расстояние от края до края, которое определяется как осевая длина отверстия ( ) в центре.
   2. Определите наибольшее расстояние сверху вниз как перпендикулярное расстояние ( ).
   3. Повторите этот процесс для всех изображений интервала растяжения и рассчитайте осевые ( ) и перпендикулярные ( ) расстояния от выреза периферии(рисунок 9A,внизу), а затем выполните следующие расчеты, чтобы найти деформации вырезанных краев:

Рисунок 9: Гелевые деформации из-за внешнего растяжения силиконовой полоски. (A) X-Y поперечное сечение нерастянутого фибринового геля (сверху), и после применения ε_{отверстия} = 64% деформации вдоль направления x (внизу). Гель сложен флуоресцентными бусинами. Соответствующие длины d и l, используемые для расчета ε_{отверстия,} указаны на изображениях(B)Увеличенные изображения пунктирной квадратной области, отмеченной в A (C)Иллюстрация типов деформаций, рассмотренных в данном исследовании: ε_{отверстие} представляет собой осевую деформацию выреза на его максимальном диаметре, а ε_гель представляет собой осевую деформацию в центре геля (измеренную по расположениям бисерного агрегата)(D)Была обнаружена линейная зависимость между ε_{отверстием} и ε_гелем в обоих направлениях xx (красная линия) и yy (зеленая линия). Эта цифра была адаптирована с разрешения Roitblat Riba et al.⁴¹Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

9. Анализ ориентации волокон

1. Используйте количественную оценку выравнивания волокон, чтобы охарактеризовать структурную реакцию волокнистого геля на увеличение величин растяжения. Загрузите изображения с высоким разрешением в программное обеспечение ImageJ FIJI (NIH)^43, а затем проанализируйте с помощью модуля OrientationJ (EPFL)⁴⁴ (Настройки: градиент Гаусса и 3-пиксельное окно, рисунок 10).
   1. Вычислить 2D нематический параметр порядка (NOP) гистограммы ориентации как:⁴⁵
      
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение NOP = 1 указывает на идеальное выравнивание по осевому направлению (нулевой угол), а NOP = 0 указывает на изотропию. Угол ориентации, θ,является углом волокна по отношению к оси деформации (оси X), полученным путем анализа изображения и точно определенным в документации OrientationJ. ^{44 44}

Рисунок 10: Анализ ориентации волокон с использованием программного обеспечения FIJI ImageJ. (A) Главное меню ImageJ со стрелкой, указывающей местоположение выпадающего меню «Плагины», где можно найти «OrientationJ». В расширенном меню 'OrientationJ' нажмите на опцию 'OrientationJ Distribution'(B)Модуль распределения OrientationJ. Установите для «Локального окна σ» значение 3 пикселя, а для «Градиента» — значение «Гауссов». Затем нажмите кнопку «Выполнить» (красная стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

10. Ручной внутренний анализ деформации геля

1. Выполняя живую визуализацию гидрогеля со встроенными шариками с высоким увеличением, вручную найдите интересующую область (ROI) с легко узнаваемыми характеристиками (например, агрегатами бусин), чтобы вернуться в то же место после каждой величины растяжения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сжатие в Z-направлении (эффект Пуассона) может привести к увеличению плотности бусин по мере увеличения растяжения, поэтому мы предлагаем выбирать бисенные агрегаты достаточно большие, чтобы их можно было четко идентифицировать. Этот протокол требует анализа центральной области фибринового геля, хотя может быть выбрана любая область.
2. В предварительном растяжении (шаг 6) запишите Z-стековое изображение выбранной окупаемости инвестиций с высоким разрешением. После каждого требуемого интервала растяжения вернитесь к той же окупаемоотвернеке инвестиций и повторите процесс захвата изображения.
3. Возьмите изображения и импортируйте их в ImageJ. В ROI запишите расположение пикселя X-Y каждого видимого агрегата бусин. Перенесите записанные данные в электронную таблицу.
4. Измерьте расстояния между каждой парой агрегатов и сравните их с расстояниями тех же пар на эталонном изображении, что позволит рассчитать деформации в направлениях X и Y.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если непрерывный фильм в реальном времени записывается во время растяжения геля (вместо статического захвата изображения), автоматический анализ деформаций может быть выполнен методами цифрового изображения или объемных корреляций (DIC / DVC), как было продемонстрировано^{ранее 46,47.} Однако следует отметить, что автоматический анализ DIC/DVC является сложной задачей в этой настройке, так как Z-стекдвижется не только в плоскости X-Y, но и в направлении Zиз-за эффекта Пуассона (сжатия), что приводит к значительным дрейфам во время записанного фильма.

Результаты

Репрезентативные данные статического растяжения возрастающих величин, нанесенного на силиконовую полосу, несущий 3D-гидрогель фибрина, встроенный флуоресцентными шариками 1 мкм, показаны на рисунке 9. Анализ демонстрирует влияние растяжения силикона на геометрич?...

Обсуждение

Способ и протокол, представленные здесь, в значительной степени основаны на нашем предыдущем исследовании Roitblat Riba et al.⁴¹ Мы включаем здесь полное автоматизированное проектирование (CAD), Python и коды микроконтроллеров устройства SCyUS.

К основным преимущества...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A20002
Cell Medium (DMEM High Glucose)	Biological Industries	01-052-1A	Add 10% FBS, 1% PNS, 1% L-Glutamine, 1% Sodium Pyruvate
Cover Slip #1.5	Bar-Naor Ltd.	BN72204-30	22×40 mm
DIMETHYL SULPHOXIDE 99.5% GC DMSO	Sigma-Aldrich Inc.	D-5879-500 ML
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline	Biological Industries	02-023-1A
EVICEL Fibrin Sealant (Human)	Omrix Biopharmaceuticals	3902	Fibrinogen: 70 mg/mL, Thrombin: 800-1200 IU/mL
Fibrinogen Buffer	N/A		Recipe for 1L: 7g NaCl, 2.94g trisodium citrate dihydrate, 9g glycine, 20g arginine hydrochloride & 0.15g calcium chloride dihydrate. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0-7.2)
Fluorescent micro-beads FluoSpheres (1 µm)	Invitrogen	F8820	Orange (540/560) Provided as suspension (2% solids) in water plus 2 mM sodium azide
High-Temperature Silicone Rubber	McMaster-Carr	3788T41	580 µm-thick E = 1.5 Mpa Poisson Ratio = 0.48 Tensile Strength = 4.8 MPa Upper limit of stretch = +300% engineering strain
HiTrap desalting column 5 mL (Sephadex G-25 packed)	GE Healthcare	17-1408-01
HIVAC-G High Vacuum Sealing Compound	Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.	HIVAC-G 100
ImageJ FIJI software39	National Institute of Health, Bethesda, MD	Version 1.8.0_112
Microcontroller (Adruino Uno + Adafruit Motorshield v2.3)	Arduino/Adafruit	Arduino-DK001/Adafruit-1438
MicroVL 21R Centrifuge	Thermo Scientific	75002470
Parafilm	Bemis	PM-996
Primovert Light Microscope	Carl Zeiss Suzhou Co., Ltd.	491206-0011-000
SCyUS CAD (Solidworks)	Dassault Systèmes	N/A
SCyUS Code37	N/A	N/A
Servomotor - TowerPro SG-5010	Adafruit	155
SL 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004030	For 50 mL tubes
Sterile 10 cm non-culture plates	Corning	430167
Thrombin buffer	N/A		Recipe for 1L: 20g mannitol, 8.77g NaCl, 2.72g sodium acetate trihydrate, 24 mL 25% Human Serum Albumin, 5.88g calcium chloride. Bring final volume to 1L with PuW (pH 7.0)
Trypsin EDTA Solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries	03-052-1B
USB Cable (Type B Male to Type A Male)	N/A	N/A
Zeiss LSM 880 Confocal Microscope	Carl Zeiss AG	2811000417
ZEN 2.3 SP1 FP3 (black)	Carl Zeiss AG	Release Version 14.0.0.0