関節疾患のモデリングと薬剤検査のための膝関節チップの作成

要約

ヒト間葉系幹細胞から4種類の組織を作製し、ヒト膝関節の軟骨、骨、脂肪パッド、滑膜を再現するための詳細な方法を提供します。これらの4つの組織は、カスタマイズされたバイオリアクターに統合され、マイクロ流体工学を介して接続されるため、膝関節オンチップが生成されます。

要約

変形性関節症(OA)のような衰弱性関節疾患の高い有病率は、高い社会経済的負担をもたらします。現在、関節障害を標的とする利用可能な薬はほとんどが緩和的です。効果的な疾患修飾OA薬(DMOAD)の満たされていないニーズは、主に疾患メカニズムを研究し、潜在的なDMOADをテストするための適切なモデルがないことによって引き起こされてきました。ここでは、ヒト間葉系幹細胞(MSC)に由来する脂肪、線維、および骨軟骨組織成分を含むミニチュア滑膜関節模倣微生物生理学的システム(miniJoint)の確立について説明します。三次元(3D)微小組織を得るために、MSCを、分化前または分化後に光架橋可能なメタクリレートゼラチンに封入した。次に、細胞を含む組織構築物を3Dプリントされたバイオリアクターに統合し、miniJointを形成しました。骨形成性、線維形成性、および脂肪生成性媒体の別々の流れを導入して、それぞれの組織表現型を維持した。一般的に共有される流れは、軟骨、滑膜、および脂肪組織を介して灌流され、組織のクロストークを可能にしました。このフローパターンにより、機構研究のための1つまたは複数の組織成分における摂動の誘導が可能になります。さらに、潜在的なDMOADは、すべての媒体ストリームを介した「全身投与」、または共有された「滑液」シミュレーションフローのみに薬物を添加することによる「関節内投与」のいずれか を介して テストできます。したがって、miniJointは、個別化医療における疾患メカニズムを効率的に研究し、薬物をテストするための汎用性の高い in vitro プラットフォームとして機能します。

概要

変形性関節症(OA)のような関節疾患は非常に蔓延しており、衰弱させ、世界中の障害の主な原因となっています¹。米国だけでも、OAは2,700万人の患者に影響を及ぼし、60歳以上の成人の12.1%に発生している^{と推定されています2}。残念ながら、現在関節疾患の管理に使用されているほとんどの薬は緩和薬であり、効果的な疾患修飾OA薬(DMOAD)は入手できません³。この満たされていない医療ニーズは、主に、疾患メカニズムを研究し、潜在的なDMOADを開発するための効果的なモデルがないことに起因しています。従来の2次元(2D)細胞培養は、関節組織の3D特性を反映しておらず、組織外植片の培養は、著しい細胞死によって妨げられることが多く、通常、動的な組織相互接続を再現できません⁴。さらに、遺伝的および解剖学的差異は、^{動物モデルの生理学的}関連性を有意に低下させる4。

臓器チップ(OoC)、または微小生理学的システムは、工学、生物学、および医学のインターフェースにおける有望な研究分野です。これらのインビトロプラットフォームは、それらのインビボ^{対応物の定義された}健康的または病理学的....

プロトコル

以下のプロトコルは、ピッツバーグ大学およびピッツバーグ大学の人間研究倫理委員会の倫理ガイドラインに従います。この研究で使用された材料に関する情報は、 材料表に記載されています。

1. 3Dプリントされたバイオリアクターの製造

1. コンピュータソフトウェアを使用して、チャンバー、インサート、および蓋を含む骨軟骨(図2A)およびminiJointバイオリアクター(図2B)を設計します。各部品の寸法情報を 図 S1 に示します。
2. デザインを3Dプリンターに転写し、フォトポリマーインクで印刷します。
3. 3Dプリントされた部品(図2C-F)を15 mLの95%エタノールで3回すすぎます。次に、印刷片を懐中電灯重合装置で200秒間完全に架橋します。
4. インサートと蓋にOリングを追加し(図2C、D)、部品がはまるかどうかをテストします(図2G、H)。

結果

ミニジョイントのすべての組織を収集し、ミニジョイントで28日間の培養後に表現型を分析しました(図4A)。これについては、以前の出版物⁷で詳しく説明されています。

RT-qPCR、免疫染色、組織学的染色により、個々の微小組織について組織特異的な表現型が良好に維持されていることが確認されました(図4)。.......

ディスカッション

本稿では、骨、軟骨、脂肪組織、滑膜様組織を間葉系幹細胞から形成し、カスタマイズされたバイオリアクター内で共培養する膝関節オンチップシステムを作成するためのプロトコルを紹介します。プラグアンドプレイ機能を備えたこの多成分ヒト細胞由来システムは、関節疾患の病因を研究し、医薬品を開発するための新しいツールです。

異なる組織が特定の培地を?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma -Aldrich	I17018-1G
6 well non-tissue culture plate	Corning Falcon® Plates	351146
24 well non-tissue culture plate	Corning Falcon® Plates	351147
30 mL syringes	BD Syringe Luer Lock Cascade Health	302832
Alcian blue stain	EK Industries	1198	1% w/v, pH 1.0
Advanced DMEM	Gibco	12491-015
αMEM	Gibco	12571-063
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240-062
Biopsy punch	Integra Miltex	12-460-407
BODIPY® fluorophore	Molecular Probes
Bone morphogenic protein 7 (BMP7)	Peprotech
Curved forceps	Fisher Brand	16100110
DMEM	Gibco	11995-065	Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Dexmethasome	Sigma -Aldrich	02-05-2002
E-Shell 450 photopolymer in	EnvisionTec	RES-01-4022
Fetal Bovine Serum	Gemini-Bio Products	900-208
GlutaMAX	Gibco	3505-061
gelatin from bovine skin	Hyclone	1003372809
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma -Aldrich	SH30588.02
indomethacin	Sigma -Aldrich	I7378-56
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)	Gibco	51500-056
interleukin 1β	Peprotech	200-01B
Leur-loc connectors	Cole-Parmer Instruments	45508-50
L-proline	Sigma -Aldrich	115388-93-7
β-glycerophosphate	Sigma -Aldrich	1003129352
Medium bags	KiYATEC	FC045
Methacrylic Anhydride	Sigma -Aldrich	102378580
Phosphate buffered Saline	Corning	21-040-CM
Pointed forceps	Fisher Brand	12000122
Silicon mold	McMaster-Carr	RC00114P
Silicon o-rings	McMaster-Carr	ZMCCs1X5	1mm x 5mm
SolidWorks	Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France
Surgical Blades	Integra Miltex	4-122
Syringe pump	Lagato210P, KD Scientific	Z569631	10 syringe racks
T-182 tissue culture flasks	Fisher Brand	FB012939
Tissue Culture Dish 150 mm	Fisher Brand	FB012925
Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3)	Peprotech	100-36E
Trypsin	Gibco	25200-056
UV Flashlight	KBS	KB70109	395 nm
Vida Desktop 3D Printer	EnvisionTec
Vitamin D3	Sigma -Aldrich	32222-06-3	1,25-dihydroxyvitamin D3