Создание коленного сустава-на-чипе для моделирования заболеваний суставов и тестирования лекарств

Резюме

Мы предлагаем подробные методы создания четырех типов тканей из мезенхимальных стволовых клеток человека, которые используются для рекапитуляции хряща, кости, жирового пакета и синовиальной оболочки коленного сустава человека. Эти четыре ткани интегрированы в индивидуальный биореактор и соединены с помощью микрофлюидики, создавая таким образом коленный сустав на чипе.

Аннотация

Высокая распространенность изнурительных заболеваний суставов, таких как остеоартрит (ОА), представляет собой высокое социально-экономическое бремя. В настоящее время доступные препараты, нацеленные на заболевания суставов, в основном паллиативны. Неудовлетворенная потребность в эффективных препаратах ОА, модифицирующих болезнь (ДМОАД), была вызвана главным образом отсутствием соответствующих моделей для изучения механизмов заболевания и тестирования потенциальных ДМОАД. Здесь описано создание миниатюрной микрофизиологической системы, имитирующей синовиальный сустав (miniJoint), включающей компоненты жировой, фиброзной и остеохондральной ткани, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека. Для получения трехмерных (3D) микротканей МСК инкапсулировали в фотосшиваемый метакрилированный желатин до или после дифференцировки. Затем тканевые конструкции, нагруженные клетками, были интегрированы в биореактор, напечатанный на 3D-принтере, образуя мини-соединение. Были введены отдельные потоки остеогенной, фиброгенной и адипогенной сред для поддержания соответствующих тканевых фенотипов. Общий поток перфузировался через хрящевую, синовиальную и жировую ткани, чтобы обеспечить перекрестные помехи тканей. Эта картина потока позволяет индукция возмущений в одном или нескольких тканевых компонентах для механистических исследований. Кроме того, потенциальные ДМОАД могут быть протестированы либо путем «системного введения» через все потоки среды, либо путем «внутрисуставного введения» путем добавления лекарств только к общему потоку, имитирующему «синовиальную жидкость». Таким образом, miniJoint может служить универсальной платформой in vitro для эффективного изучения механизмов заболевания и тестирования лекарств в персонализированной медицине.

Введение

Заболевания суставов, такие как остеоартрит (ОА), широко распространены и изнурительны и представляют собой ведущую причину инвалидности во всем мире¹. По оценкам, только в США ОА поражает 27 миллионов пациентов и встречается у 12,1% взрослых в возрасте 60 лет и старше² лет. К сожалению, большинство препаратов, используемых в настоящее время для лечения заболеваний суставов, являются паллиативными, и нет эффективных препаратов, модифицирующих болезнь ОА (DMOAD)³. Эта неудовлетворенная медицинская потребность в первую очередь связана с отсутствием эффективной модели для изучения механизмов заболева....

протокол

Следующий протокол следует этическим принципам Университета Питтсбурга и комитета по этике исследований на людях Университета Питтсбурга. Информация о материалах, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Производство биореакторов, напечатанных на 3D-принтере

1. Используйте компьютерное программное обеспечение для проектирования остеохондральных (рис. 2A) и мини-биореакторов (рис. 2B), которые включают камеры, вставки и крышки. Информация о размерах каждой детали показана на рисунке S1.
<....

Результаты

Все ткани мини-сустава были собраны для анализа их фенотипов после 28 дней культивирования в мини-суставе (рис. 4А). Это было подробно описано в нашей предыдущей публикации⁷.

С помощью ОТ-кПЦР, иммуноокрашивания и гистологического окрашивания б?.......

Обсуждение

В этой статье мы представляем протокол создания системы коленного сустава на чипе, в которой кости, хрящи, жировая ткань и синовиально-подобные ткани формируются из МСК и совместно культивируются в индивидуальном биореакторе. Эта многокомпонентная система на основе клеток человека с ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-isobutyl-1-methylxanthine	Sigma -Aldrich	I17018-1G
6 well non-tissue culture plate	Corning Falcon® Plates	351146
24 well non-tissue culture plate	Corning Falcon® Plates	351147
30 mL syringes	BD Syringe Luer Lock Cascade Health	302832
Alcian blue stain	EK Industries	1198	1% w/v, pH 1.0
Advanced DMEM	Gibco	12491-015
αMEM	Gibco	12571-063
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240-062
Biopsy punch	Integra Miltex	12-460-407
BODIPY® fluorophore	Molecular Probes
Bone morphogenic protein 7 (BMP7)	Peprotech
Curved forceps	Fisher Brand	16100110
DMEM	Gibco	11995-065	Dulbecco’s Modified Eagle Medium
Dexmethasome	Sigma -Aldrich	02-05-2002
E-Shell 450 photopolymer in	EnvisionTec	RES-01-4022
Fetal Bovine Serum	Gemini-Bio Products	900-208
GlutaMAX	Gibco	3505-061
gelatin from bovine skin	Hyclone	1003372809
Hank’s Balanced Salt Solution	Sigma -Aldrich	SH30588.02
indomethacin	Sigma -Aldrich	I7378-56
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)	Gibco	51500-056
interleukin 1β	Peprotech	200-01B
Leur-loc connectors	Cole-Parmer Instruments	45508-50
L-proline	Sigma -Aldrich	115388-93-7
β-glycerophosphate	Sigma -Aldrich	1003129352
Medium bags	KiYATEC	FC045
Methacrylic Anhydride	Sigma -Aldrich	102378580
Phosphate buffered Saline	Corning	21-040-CM
Pointed forceps	Fisher Brand	12000122
Silicon mold	McMaster-Carr	RC00114P
Silicon o-rings	McMaster-Carr	ZMCCs1X5	1mm x 5mm
SolidWorks	Dassault Systèmes SE, Vélizy-Villacoublay, France
Surgical Blades	Integra Miltex	4-122
Syringe pump	Lagato210P, KD Scientific	Z569631	10 syringe racks
T-182 tissue culture flasks	Fisher Brand	FB012939
Tissue Culture Dish 150 mm	Fisher Brand	FB012925
Transforming Growth Factor Beta (TGF-β3)	Peprotech	100-36E
Trypsin	Gibco	25200-056
UV Flashlight	KBS	KB70109	395 nm
Vida Desktop 3D Printer	EnvisionTec
Vitamin D3	Sigma -Aldrich	32222-06-3	1,25-dihydroxyvitamin D3