Name: cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products
Uploaded: 2015-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
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The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

注：このプロトコルですべての手順は、英国内務省とエディンバラ獣医サービスの大学が定めたガイドラインに従って行われる。 強制経口マウスの1。感染<ol><li> 4℃で6ヶ月までのための蒸留水に保管Heligmosomoides polygyrus L3幼虫。 </li><li>使用前に、L3幼虫を蒸留水で3回洗浄：（ブレーキ付）10分間300×gで遠心分離し、水500μlのが、すべてを削除（ペレット化L3幼虫を乱さないように）、ペレットたびに懸濁します。 </li><li> 3回目の洗浄のために、その開口部を広げる正確なボリューム（通常は40ミリリットル）と吸引200μlの先端カットで20μlに水を加える。 60mm培養皿の表面にある2つの20μlのサンプルを配置し、（通常はモバイル、最高の解剖顕微鏡で50倍の倍率で見て）L3幼虫を数える。 concentratio蒸留水で最終ペレットを再懸濁1mlあたり2000 L3幼虫のN。 </li><li>ライフサイクルの生産のために、8週齢のF1（C57BL / 6xCBA）マウスは、400 H.で感染経口胃管栄養法により蒸留水200μl中polygyrus L3幼虫（首筋によって直立位置でマウスを拘束し、静かに胃に口や食道を通っ鈍い強制経口針を渡す）。攪拌各感染症（幼虫は水に迅速に解決する）と吸引1mlシリンジで200μlの前に十分。丸みを帯びた端部を有する専用の強制経口針を使用しています。 （6〜8週齢）若いマウスの実験的感染、または他の近交系（ 例えば 、C57BL / 6またはBALBC）の場合は、200 L3幼虫をマウスに感染させる。 </li></ol> 2.伝播とHのメンテナンスpolygyrus <ol><li>大型プラスチック浴槽の中央に炭を置き、冷たい水道水を最低30分間​​その上で実行できるようにする（未洗浄活性炭は、L3幼虫に対して毒性である）。水槽から水を排出し、T ON炭を置く吸収紙の層WO、それが完全に乾燥するまで室内空気にさらされたまま。 </li><li>卵が必要な場合は（必要に応じてハサミ）、最初の鉗子とコロンから糞をこすり。 L3幼虫の多数が必要な場合、ワイヤーグリッド上にマウスを置き、数日間の糞を収集する。 </li><li>濾紙に付着するのに十分なだけ、湿った一貫性を達成するために、1：1以上の割合で造粒炭と糞便を混ぜる。ペトリ皿にいくつかの湿らせたろ紙の中央に薄い層を塗抹し、12〜14日、暗所で（一部の湿ったペーパータオルと水の一品を追加）湿潤箱にこれを配置します。 </li><li>以降7日目からL3幼虫を外し、紙が廃棄される前に、少なくとも2の機会をそれらを集める。幼虫はろ紙のエッジの周りにリングを形成する。ペトリ皿から濾紙を持ち上げて、50mlのチューブに（ピペット、プレートあたりの滅菌水5mlを用いて）、プレートの左右され幼虫をすすぐ。 </li><li>リフトろ紙から、残りの幼虫を収穫を50mlチューブに蒸留水を用いてプレート上に残した。 10分間300×gで流出溶液を遠心します。蒸留水で幼虫を3回洗浄した後、必要になるまで蒸留水の最大50ミリリットルで、4℃で保存する。 注：幼虫が生存したままで少なくとも6ヶ月間感染性。 </li></ol>大人Hの3コレクションpolygyrusワーム<ol><li> 図1に示すように、事前に修正されたベールマン装置を準備します。 </li><li> 14日、感染後カルマウス。 </li><li> 70％エタノールで腹部を洗ってください。腹部の皮膚をカットし、前腹壁を明らかにするために引き戻す。腹膜腔を入力するように正中切開を行います。 </li><li> （遠位直腸への近位十二指腸から）全体の小腸および大腸を削除します。ドライペトリ皿に置きます。 </li><li>その全長に沿って腸をまっすぐに。消費税​​糞含有コロン。後で卵の準備のために別々の皿にこれを置く。 </li><li>物品税によるもの腔内ワームに十二指腸の比較的厚い壁と、多くの場合、赤の出現によって-identified成虫が含まれている小腸の近位20センチメートル。ハンクスソリューションを5 mlの（直径100mm）ペトリ皿に置き、37℃（ディッシュあたり2つの試料）に温めた。 </li><li>ハサミで縦方向にワームで満たされた近位腸の部分を開きます（ラウンドエンド型ハサミはこのために最善である）、およびワームを削除するには2枚のスライドガラスライニング腸の内側にダウンこすり。その後、きれいな腸壁を捨てる。 </li><li>小さ ​​なモスリン袋にヒントワームは、主食は閉じられ、ガラス漏斗（ 図1）のエッジの周りペーパークリップで固定します。 </li><li>ハンクス液で漏斗を記入し、それぞれの漏斗内にワームの約4ペトリ皿を追加します。 </li><li>優しく除去するために通過途中を攪拌する1〜2時間、37℃のインキュベーター内の場所装置、モスリンフィルタを閉塞することができる腸の準備から破片。モスリンバッグ外側の破片の流出を避けるために注意してください - これは、最終的なHES製剤の汚染の原因となります。成虫はゆっくりモスリン布を通って移動し、ガラス試験管の底に沈降している必要があります。慎重にシンク（この時点でワームを失わないように注意しながら）経由で接続ゴムホースから試験管を取り外してください。 </li><li>プラスチックピペットを用いて、50ミリリットルチューブにワームを転送し、 &#39;（ワームは、重力との和解stripetteでメディアを取り出し、ハンクスの40ミリリットル追加できるようにソリューション」ソリューションと5回繰り返す）ハンクスで6回洗う。 注：このワーム文化はこれ以降から無菌に保つ必要があります。 <ol><li>層流フードに移動し、100 U / mlペニシリンおよび100μg/ mlストレプトマイシン、 インビトロ培養の準備ができて補充した無菌ハンクス液で別の6回洗浄する。 </li></ol></li><li>カウントその開口部を拡大する黄色の先端カットに取り20μlの二つのサンプルを取ることによって回収成虫。接種した幼虫の量の約50％を期待しています。 </li></ol>培地調製、成虫を洗浄：4. HESのための文化を設定する<ol><li> RPMI約10mlの3.11から虫を浸すワームが完全に覆われるようにする角度でチューブ止まり、20分間、10％のゲンタマイシンを補充した。 </li><li>層流フードでこれを実行します（5 U / mlペニシリンおよび5μg/ mlのストレプトマイシンを補充）ハンクス液で再び6回洗浄する。 </li><li> H.を準備polygrus媒体 。 </li><li> 100倍Peniclllin - ストレプトマイシン（最終濃度5 U / mlペニシリン、5mlの、（RPMI1640 0.2％グルコースを含有するもので、最終濃度1.2％）45％グルコース11.1ミリリットル追加、RPMI1640の500mlに、層流フード内で無菌性を維持する5μg/ mlのストレプトマイシン）、L-グルタミン（最終濃度2mM）を5mlの、及びゲンタマイシン（最終濃度1％）を5ml。 FCSを追加しないでください。 </li><li>通気T25フラスコにアリコートワーム、約。 15ミリリットルH. 1,000ワームpolygyrusフラスコ当たり媒体、及び37℃のインキュベーター（5％CO 2）3週間で直立場所。 </li></ol> HESの5。準備<ol><li> （ - 別々に処理または廃棄することができる起因するLPS混入と宿主タンパク質の高レベル）培養24時間後の最初のコレクションはさておき設定、もはや週2回以上の間隔で培養物からHES含有培養培地を収集します。個別の各コレクションを維持し、明確に日付とバッチ番号で標識した。 H.等量のと交換してください各機会にpolygyrusメディア 。 </li><li> 5分間400×gで遠心HES含有培地。その後、50ミリリットルチューブに0.2ミクロン低タンパク質結合フィルターを通して滅菌ろ過する。 -20℃の冷凍庫に保管しては明らかにHES cのワームの収穫の日付と日付で標識したollection。 </li><li>培養物からHESコレクションの21日後に、ワームを捨てる。 </li><li> （通常、凍結ストックから、そして最初の24時間のコレクションを含まない）と窒素圧力下で限外濾過装置で3000 MWCOフィルター上で濃縮するHES上清のプール500〜1,000ミリリットル。 注：フィルタの実行を乾燥させるないように注意してください。 <ol><li>フィルタ装置を設定するには、最初に撹拌しながら3×20分間蒸留水で1リットルのビーカーにダウン3 kDaの膜光沢のある側を洗う。フィルター膜光沢のある面を上にして、製造業者の指示に従って限外ろ過装置を組み立てます。 4℃でのキャビネットに置き、そしてプールHESを濃縮するために開始する前に通って蒸留水50mlを渡す。 </li><li>必要に応じてボリュームが2〜5ミリリットルに濃縮されるまで、（1日100〜140ミリリットル）濾過装置にHESの各チューブを追加します。 </li></ol></li><li> HES含有培地から汚染物質を除去するために、pyrで50mlのを追加その後、濾過装置にフィブリノーゲンを含まないPBSとし、約2mlまで濃縮する。二回（合計でPBSの150ミリリットル）、この手順を繰り返します。フィルタは、層流フード内（0.2μmフィルターで）滅菌し、分光光度計を用いてタンパク質濃度を測定し、15mlチューブにHESを移す（E 280 = 10）またはBradfordアッセイによって。 </li><li>アリコート、バッチ番号と日付ラベル、および-80℃で凍結する。 </li><li>使用前にHESの各バッチに、製造業者のプロトコールに従って、発色性LALアッセイを行う。 LPSレベルは1μgタンパク質あたり1 U LPSよりも大きい場合には、in vivoでの実験のためにまたはインビトロ培養において 、このバッチを使用しないことを検討してください。 </li><li>同様に、別々に24時間後に収集したHESを処理します。それは、機能の実験には適していないが、それはモノクローナル抗体の親和性精製によって単離することができるよう、個々の分子の有用な供給源であり、LPSおよびいくつかの宿主タンパク質を含有します。 </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

H.のライフサイクル確実に一貫性のある方法でpolygyrusが進行する。 0日目に自然な摂取またはL3幼虫の強制経口投与に続いて、嚢胞は幼虫の脱皮に進み、5日目までに十二指腸漿膜下に形成し始め、その後10日目から腸管内腔に成虫として浮上し、卵は糞便で見ることができます14日目および肉芽プロトコルは、上述の（および図6にまとめた）Hの高スループット生産を可能にする21日目から十二指腸の漿膜表面上に表示され今後の実験的およびライフサイクル·感染症のための実行可能なL3幼虫の信頼性回復に加えてpolygyrus排泄·分泌産物（HES）、。 H. polygyrus感染は、OVAまたはのDer p 1を（ハウスダストダニアレルゲン）14依存性喘息のモデルにおいて保護的であることが示されている。さらに、気道炎症の抑制は、CD4 + CD25 +で転送することができ</suのp&gt;調節性T細胞は、14またはCD19 + CD23 ハイ調節性B細胞からの24 H.、非感作polygyrusは、マウスを感染した。自己免疫のモデルでは、H。 polygyrus感染 、多発性硬化症9の実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）モデルにおける抑制性であることが示されており、および抑制は、感染したマウス24からのCD4 + T細胞またはCD19 + B細胞のいずれかを転送することができる。 Heligmosomoides polygyrus排泄·分泌産物（HES）宿主免疫応答を調節し、（ 図7で概説）多数の機構によってTh2に仲介される炎症を抑制、を含む：刺激25への樹状細胞応答性のa）の阻害、CD4のb）の誘導+のFoxp3 +制御性T細胞18。およびc）IL-33の産生20の遮断を。投与された場合HESは保護的であることが示されているTの感作またはチャレンジ喘息19のOVA-ミョウバンモデルでも初期のIL-33の放出の抑制を通じて、ルナリアエキスアレルゲン20を鼻腔内投与した場合。 HESのLPS汚染の回避は、多くの場合、将来の免疫学的実験の成功のために重要です。ここで説明したプロトコルでは、これを達成するための重要なステップは、（2.10を参照）、培養の最初の24時間別にESソリューションを設定するために、最終的なHESの準備に入らないベールマン装置のモスリンバッグ内に含まれるその破片を確実にするためである（5.1を参照）。 ここ数年、HESは徹底的に370以上の異なるタンパク質とプロテオミクスレベルで特徴づけられている26,27を同定した。また、第4段階の幼虫からのESはプロテオーム解析28が施されている。進行中の作業は、3強力に免疫原性であることが知られているHESの主要グリカン成分を特徴付ける含み、マイクロRN分泌そのは50〜100 nmの小胞またはエキソソーム（降圧ら 、公表のために提出された）でカプセル化されたよう。この高度に免疫調節寄生虫から、とHESの分子成分を特定する大規模なプロテオミクスデータを持つESの収集のための再現可能なプロトコルの設立により、ステージは今の識別およびH.から個々の分子の治療的テストのために設定されている宿主免疫系のキー効果を媒介することができますpolygyrus。

Heligmosomoidesのpolygyrusは密接に高度に普及している人間の線虫寄生虫1に関連している天然のネズミ胃腸蠕虫である。そのようなNippostrongylusパラゴムノキ、H.など、他の線虫モデルとは対照的にpolygyrusは一貫して、それが宿主の免疫応答2を抑制するために採用して、複数の強力な免疫調節機構の直接の結果として、マウスにおける慢性感染を確立します。 H.のpolygyrusは、直接ライフサイクルがあります：彼らは腸管腔に戻る前に十二指腸及び被嚢の漿膜層に移動、そこで感染性L3幼虫は、FeCo系経口送信（または実験室の設定で強制経口投与）によって摂取される約8日最初の感染後に成虫。交尾と卵の生産は、10日目によって発生し、それがDAから排泄-の分泌産物の文化や収集のための大人のワームを収穫することが可能であるY 14年以降3。H. polygyrusまた、感染感受性マウス4-6の存在増加乳酸菌、及びHのレベルの増加と、共生微生物相と相互作用し、乳酸菌6匹のマウスの暴露後のpolygyrus感染。 H.と活動性感染polygyrusは、自己免疫7-10の多くの動物モデルにおいて免疫病理から保護することが示されており、11,12及びアレルギー13-16大腸炎。その結果、生体内17,18に病理をダウン調節するこの寄生虫（「HES」）から排泄分泌分子の潜在的に大きな関心が集まっている。確かに、保護効果は今18,20が特定されている経路を介してHES製品19を用いたマウスの治療後に見られている。ここでは、その分泌された製品の信頼性のあるHeligmosomoidesのpolygyrusの生産と回復のためのプロトコルを記述それはさらに、機能的、生化学的および免疫学的研究の範囲のために利用することができる。

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

Heligmosomoides（また以前Nematospiroidesのdubiusとして知られており、H. bakeriなどの一部によって参照）polygyrusマウスにおける慢性感染を確立するために、複数の免疫調節メカニズムを採用し、密接に普及している人間の蠕虫感染症に似ている胃腸蠕虫である。H. polygyrusは蠕虫由来の免疫調節の分野で広く研究されており、強力アレルギーおよび自己免疫の実験モデル（活動性感染および単離された分泌産物の両方）を抑制することが見出されている。このホワイトペーパーで説明されたプロトコルは、Hの管理を概説彼らの排泄·分泌産物（HES）の一貫性のL3幼虫の生産、大人の寄生虫の回復、および収集のためpolygyrusライフサイクル 。

H.による感染に対する感受性polygyrusマウス株（ 表1）の遺伝的背景によって大幅に制御される。 C57BL / 6およびCBAマウスは、21,22非常に敏感である。寄生虫のライフサイクルの維持には、これら2つの株の間F1ハイブリッドは、いずれかの親株と比較して、病的状態（過度の腸上皮損傷）なしにはるかに高いワーム負担に耐える能力のために選択されている。 200 L3幼虫の投与量は、一般的にホモ接合近交系（ 例えば 、C57BL / 6の実験のために使用されている間400 L3幼虫の経口胃管栄養法は、F1マウス（ 図2に示されている成体ワームの負担を生じる）でライフサイクルを維持するために使用されまたはBALBC）。しかし、この投与量は、腸内細菌叢の変化などの動物施設、間で異なることが環境的コファクターに応じて減少する必要があるかもしれません。 HESのバッチは、再現可能なEFFIを証明した機能アッセイおよびタンパク質組成でcacy。培養の各連続週間からの上清は、4週間の合計まで、分析したとき、さらに、タンパク質のプロファイルは非常に類似していることが見出された（ 図3）。HES濃度をBradfordアッセイ（5.5を参照） を 、合計することによって測定した場合タンパク質は、通常、約1 mg / mlで（ 図4）。 HESを濃縮する別の方法は、サンプルは、緩衝塩および低分子量成分を除去し、スイングアウトローター遠心機で最大4,000 gで回転させた遠心濃縮器（例えばビバスピン3-kDaカットオフ膜）である。遠心濃縮は、小さな処理量（1〜10 ml）のに最適であり、約30倍の最大濃縮係数に制限されています。 HESを収集する際、汚染の回避が重要です。ホスト分子の混入を避けるために、HES-続きを捨てるマウスの腸からの成虫の収穫後の最初の24時間の培養培地をaining。また、色素産生LALアッセイ（5.7を参照）HESの各バッチにおけるLPS汚染のレベルを定量化する。 LPSの1 Uは、〜100 pgのLPSに相当し、これ以下のレベルは23無視できると考えている。私たちの手では、HESのほとんどのバッチがこの限界より大きく、0.23 U /μgのものHES中のLPSの平均濃度（ 図5）である。病理学のin vivoモデルにおいてLPSの効果は、（例えば、喘息応答の抑制）がLPS 23の少なくとも10 ngのを必要とする。したがって、100 PG LPS /μgのHESとバッチから5μgのHESのインビボ投与 500のPG LPS、よく下のLPSが問題となる有効濃度が含まれます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> 図1：ベールマン装置 ·ベア大人のHの収集のためのマン装置のセットアップpolygyrus（セクション2で説明したように）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> 図2：14日間400 L3幼虫平均ワームの感染後の平均ワーム負担は 14日400 L3幼虫を感染させた後負担。示したデータポイントは、C57BL / 6xCBAマウスの感染の19の別々のラウンドからのものである。 ±SEMを示す意味。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> 図3：文化の連続した週に集めHESタンパク質の文化のSDS-PAGEプロファイルにおける連続数週間から数HESのタンパク質プロファイル 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> 図4： </s·チョン&gt; 500ミリリットルのES-含む培養上清の約500ミリリットルに由来し、11の異なるバッチからHESタンパク質のメディア収量からHESの最終数量 。 ±SEMを示す意味。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> 図5：リムルスameobocyteアッセイにより測定されたHESの41バッチでLPS混入のHESレベルのLPS汚染 。中央値LPS HES mg当たり濃度= 86、U。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> 図6：Hのアニメーション概略 HESの単離の幼虫と成虫の回収を通じてL3幼虫の経口胃管栄養からキーライフサイクル段階のpolygyrusライフサイクルの概要、。 図7：アニメーションHESの回路図とその機能 HES内に含まれる水溶性メディエーターとエキソソームの主要免疫調節効果。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 遺伝子型（及びバックグラウンド株） </td><td> 一次感染の表現型 </td><td>リファレンス</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>近交系</td><td></td><td></td></tr><tr><td> / J、CBA、C3H </td><td>高感受性</td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6およびC57BL / 10 </td><td>影響を受けやすい</td><td> 22,30 </td></tr><tr><td>のBALB / c、DBA / 2、129 / J </td><td>中間の</td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH、SJL、SWR </TD&gt; <td>低感受性</td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> サイトカインまたはサイトカイン受容体のためのトランスジェニック </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td>影響を受けやすく</td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2">影響を受けにくい（a）の全く感受性の変化ないが、増加した肉芽腫（B） </td><td> （a）は、33 </td></tr><tr><td> （b）は34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβジェニック（C57BL / 6） </td><td>耐性</td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td>高い繁殖力</td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - （C57BL / 6またはBALB / c）の</td><td>高感受性</td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - （BALB / cまたはC57BL / 6） </td><td>高度に抵抗</td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9トランスジェニック（FVB） </td><td>耐性</td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - （C57BL / 6） </td><td>欠損のTh2、肉芽腫gormationの減少</td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - （BALB / c）の</td><td>影響を受けやすく</td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R（T1 / ST2） - / - （BALB / c）の</td><td>感受性の変化なし</td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn（C57BL / 6） </td><td>ハイのTh1、感受性増大</td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> T細胞マーカーのためのトランスジェニック </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - （BALB / c）の</td><td>わずかに高い繁殖力</td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86（B7-2） - / - （BALB / c）の</td><td>高い繁殖力</td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - （BALB / c）の</td><td>高い繁殖力＆＃160; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> 先天性免疫遺伝子座についてトランスジェニック </td><td></td></tr><tr><td> 1型インターフェロン受容体（IFNAR） - / - （C57BL / 6） </td><td>高い繁殖力、より多くの肉芽腫</td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88非 - / - （C57BL / 6） </td><td>より耐性、より多くの肉芽腫</td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW /ウェストバージニア（WBB6） </td><td>影響を受けやすく</td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> 表1：H.による一次感染遺伝的に異なると遺伝子-攻撃対象マウス系統でpolygyrus。

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Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Heligmosomoidesのpolygyrusは密接に高度に普及している人間の蠕虫感染のそれに似ている強力な免疫調節機能を備えたマウスの線虫である。ここでは、Hの長期維持のためのプロトコルを記述しpolygyrusのライフサイクル。

の栽培<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus：</em&gt;免疫調節虫寄生虫とその分泌製品

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.2K ビュー.  University of Edinburgh.  Heligmosomoidesのpolygyrusは密接に高度に普及している人間の蠕虫感染のそれに似ている強力な免疫調節機能を備えたマウスの線虫である。ここでは、Hの長期維持のためのプロトコルを記述しpolygyrusのライフサイクル。 

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Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

体液性免疫のキープレーヤーの解明: 高度なマウス Peyer のパッチからのリンパ球の隔離のプロトコルを最適化

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

がん研究

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

免疫・感染学

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in high demand. With a close genetic and behavioral resemblance to humans, small animals such as the mouse are good candidates for human disease models, through which human-like symptoms and responses can be recapitulated. Further, the mouse genetic background can be altered to accommodate diverse demands. The NOD/SCID/IL2r&#947;null (NSG) mouse is one of the most widely used immunocompromised mouse strains; it allows engraftment with human hematopoietic stem cells and/or human tissues and the subsequent development of a functional human immune system. This is a critical milestone in understanding the prognosis and pathophysiology of human-specific diseases such as HIV/AIDS and aiding the search for a cure. Herein, we report a detailed protocol for generating a humanized NSG mouse model (hu-NSG) by hematopoietic stem cell transplantation into a radiation-conditioned neonatal NSG mouse. The hu-NSG mouse model shows multi-lineage development of transplanted human stem cells and susceptibility to HIV-1 viral infection. It also recapitulates key biological characteristics in response to combinatorial antiretroviral therapy (cART).

This protocol provides a method to establish humanized mice (hu-NSG) via intrahepatic injection of human hematopoietic stem cells into radiation-conditioned neonatal NSG mice. The hu-NSG mouse is susceptible to HIV infection and combinatorial antiretroviral therapy (cART) and serves as a suitable pathophysiological model for HIV replication and latency investigations.

ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス感染モデルにおけるIL-9産生リンパ系細胞研究戦略

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

の栽培

要約

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体液性免疫のキープレーヤーの解明: 高度なマウス Peyer のパッチからのリンパ球の隔離のプロトコルを最適化

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

インビトロアッセイで HIV特異的CD4 T細胞エフェクター機能に対する免疫調節経路の影響を評価する

ヒト NOD/SCID/IL2rγ の^null (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

ワクチン接種後のモルモットモデルメジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス感染モデルにおけるIL-9産生リンパ系細胞研究戦略

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ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

ハチミツガ口腔管理モデル Study Commensal-Induced 自然免疫応答

腸内調節制御T細胞誘導の生体内増強

ニッポストロンギルス・ブラジリエンシス感染モデルにおけるIL-9産生リンパ系細胞研究戦略

ヒト NOD/SCID/IL2rγ の^null (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

ワクチン接種後のモルモットモデルメジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ