This article was supported by Award Number R01GM087227 from the National Institute of General Medical Sciences, the Norman Ackerman Advanced Research Program, and the Robert A. Welch foundation (Grant A-1769).

1. SPPS：CK（TMR）TATG（fTAT）の合成注：dfTATを形成するジスルフィド結合二量体化に続いて、固相ペプチド合成によってfTATモノマーの合成：dfTATは二段階で製造されます。 <ol><li> 1時間の標準的な50 mlのSPPS容器中にジメチルホルムアミド（DMF）中のRinkアミドMBHA樹脂500mgの膨潤。 </li><li> 20％ピペリジン溶液（DMF中20％ピペリジンを10ml（0.30ミリモル）中のFmoc保護樹脂をインキュベートすることによってFmoc脱保護を行う。使用した洗浄工程で（1×5分間および1×15分）で2回脱保護工程を実行し反応の間にDMF（洗浄工程は、約150 mlのDMFの総容積で樹脂を複数回洗浄し、真空ろ過により溶媒を除去することを含みます）。 </li><li> RinkアミドMBHA樹脂にCK（TMR）RKKRRQRRRG（fTAT）を合成。使用したFmocは、アミノ酸の保護以下：Fmoc-Lys（Mtt）-OHを（N末端のみに）、のFmoc-Lysのカルボニル（Boc）を-OH、のFmoc-Glyを-OH、のFmoc-Argの（はPbf）-OH、のFmoc- GLN（Trtの）-OH、およびFmoc-Cysを（Trtの）-OH。反応を攪拌するN 2（20 PSI）を使用して反応を行います。室温で全ての反応を実行します。 <ol><li> 4時間、各アミノ酸カップリング反応を行います。各カップリングのため、のFmocアミノ酸（1.2ミリモル）、N、N、N &#39;、N&#39; -Tetramethyl- O-（1 H -benzotriazol -1-イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）（0.44グラム、1.1ミリモル保護使いますDMFに溶解）、およびジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（0.51ミリリットル、3.0ミリモル）。 4時間のカップリングに続いて、ステップ1.2で説明したようにDMFで樹脂を洗浄し、Fmoc脱保護ステップを実行します。 </li><li>合成した：fTATの直鎖状ペプチド鎖（CKRKKRRQRRRGなしTMRリニアペプチド鎖が）まで繰り返します。 </li><li>そして、徹底的に最初にDMFを使用して、ジクロロメタン（DCM）であることを以下の樹脂を洗浄。 DMFまたはDCMの約150ミリリットルの全容量で樹脂を複数回すすぎ、真空濾過により溶媒を除去します。 </li><li> USE MALDI-TOFは、得られたペプチドは、適切な分子量を有することを確認しました。 <ol><li>水溶液とアセトニトリル50μlの0.01％TFAを50μlからなる溶液にマトリックス1mgを追加することにより、マトリックスミックスを行います。 </li><li>直鎖状ペプチド鎖の質量、使用αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を確認します。粗ペプチドの分析HPLCを実行し、純粋なピークの頂点から50μLを集めます。 </li><li> MALDIプレート上にプレートに試料を調製するために：乾燥または37℃の熱板上を空気にMALDIプレート上にマトリックス溶液と場所の2μlにペプチドの8μLを追加します。 注：アルギニンは、SPPS中のカップルに困難なアミノ酸であることが知られています。成功したカップリングはKaiser試験14（例えば、ニンヒドリンテスト）を実行することによって確立されます。このテストでは、樹脂上にカップリングしていないままになることがあり遊離アミンの検出を可能にします。場合に青色が（遊離アミンの存在を示す）を検出し、結合のTEPSを繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li> CKのために（-NH-TMR）TATG（fTAT）、1％トリフルオロ酢酸（TFA）、2％トリイソプロピルシランからなる溶液でCKでのLysのアミノ基で（-NH-MTT）をTATGのMtt保護基を開裂DCM（TIS）。 <ol><li> MTT保護基の除去には、黄色の色が観察されなくなるまでこれを繰り返して、5分間、上記溶液20mlで樹脂をインキュベートし、イエロー色の外観をもたらすように。間に、DCM、DMFで樹脂を洗浄します。 TISは、MTTを清掃うスカベンジャーであることからさらに、一度何の黄色はMTTの存在下で、溶液中で表示されません。 </li><li>これ以上MTTが削除され、溶液は透明のままであることを保証するための樹脂に、DCM中の1％TFA（無TIS）と追加の溶液を加えます。 </li></ol></li><li> DMF中のカルボキシ（TMR）、HBTU、およびDIEA（（）MG中の樹脂の量に対して4、3.9および10等価）、この混合物を追加します。3成分を溶解樹脂に、反応を実施O / Nで攪拌を提供するために、乾燥N 2を用いました 。 </li><li> Fmocの脱保護およびアミノ酸結合後、DCMで樹脂を洗浄し、乾燥させます。樹脂からのペプチドの完全な切断のために、3のためのペプチジル樹脂を92.5％TFA、2.5％H 2 O、2.5％TIS、2.5％のエタンジチオール（EDT）（総容積= 4 ml）を含有する溶液を加え樹脂からグローバルな脱保護および切断を達成するために、室温で時間。 <ol><li> Et 2 O 40ミリリットルにステップ1.6からの溶液を排出することによって冷たい無水エチルエーテル（Et 2 Oで）を使用して、粗ペプチド産物を沈殿させ、4℃でスピンダウンし、20 4,000 XG - 25分。冷たい無水Et 2 Oで沈殿物を洗浄できるようにするには、この手順を繰り返し</li><li>水（5 mlまたは沈殿物が完全に溶解するまで）、および凍結乾燥の沈殿物を再懸濁します。その後、0.1％TFA水溶液/アセトニトリル中で得られた生成物を再懸濁します。 </li></ol></li> &lt;李は&gt;各ペプチドを分析するための分析C18カラム（5ミクロン、4×150ミリメートル）でHPLC分析を行います。 1ml /分、および214nmで検出し、550nmでの流量を使用します。 </li><li>ペプチド精製のためのC18 10×250mmカラム上の分取用HPLCを実行します。 214 nmおよび550 nmでのフロー4ミリリットル/分の速度、および検出を使用してください。すべての実行については、0.1％TFA水溶液（溶媒A）、90％アセトニトリル、9.9％の水、0.1％TFA（溶媒B）の直線勾配を使用しています。 </li><li> fTAT、予想質量：2,041.17、観察された質量：2040.66、製造業者のプロトコルに従って、MALDI-TOFによりペプチドの正確な身元を確認してください。 DEAC-K9、予想質量：1,415.59：1,412.97は、質量を観察しました。 MALDI-TOF用のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを使用してください。 </li></ol> 2.酸化反応：dfTATジェネレーション<ol><li> 1時間（以下の反応のための少なくとも5 ml）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4中に通気。 </li><li> AERにfTAT（0.3ミリグラム、1.5×10 -4モル）を溶解PBSのpHを7.4（5 ml）をated。ペプチドを添加した後、7.5 - pHが7.0の間にあることを確認してください。バック7.4までのpHを - （5μlの1 M、少しずつ1）水酸化ナトリウムを追加しない場合。 </li><li>注：PBSに溶解した酸素はfTAT上のチオール基を酸化し、ジスルフィド結合を形成するように作用します。 </li><li>それが完了（HPLC分析に基づいて、100％の収率）まで反応することを可能にする反応章動O / N。逆相HPLCを用いて生成物を精製し、ステップ1.9のように質量分析法（MALDI-TOF）によって分析します。期待質量：4,084.21：4,080.34は、質量を観察しました。 </li><li>凍結乾燥純粋dfTAT（0.71×10 -4 mmol）および200μlの水に再懸濁し（濃度純粋dfTAT = 356.3μM）。 </li></ol> 3. dfTAT濃度を測定<ol><li> 50 mMのTCEP溶液を149μlの精製したdfTAT（精製されたペプチドの量に応じて、通常は1マイクロリットル）のアリコートを再懸濁します。 </li><li>注：このステップではdfTATは、そのMOに還元されます原因dfTATでTMRの蛍光団（dfTATにおけるTMRの吸光係数εが減少fTATにおけるTMRのεと比較して減少している）の近接に発生した吸光度消光を排除するnomer対応fTAT。 </li><li> （分析HPLCはfTATの形成を確認するために使用することができる）、サンプルを約20分間反応させます。 </li><li>石英キュベットにすべてのソリューションを追加し、556 nmの吸光度を測定します。 </li><li>ベールの法則を用いて（A =εcl：ε= 91500 M -1 cm -1で）は 、fTATの濃度を計算dfTATの濃度を決定し、2で[fTAT]分割します。 </li></ol> 4.細胞配信実験<ol><li> 90％（例えば、8ウェルまたは24ウェルディッシュ） - 80の密集度でシャーレ内の細胞（HeLa細胞、HDF など ）をシード。 37℃で90％の密集度-適切な培地中で細胞を増殖させる80まで（例えば、DMEM、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）5％のCO 2を含む加湿雰囲気。 </li><li> （200μlのPBSを追加し、それを3回除去することによって）、PBSで細胞を3回（3回）洗浄します。 </li><li> （8のためによく全量を200μlのでなければならない一品）NRL-15培地中で（水中）dfTATの株式を希釈することによりdfTATの作業濃度5μMを行います。 5μMdfTATの濃度は、現在までに試験されたほとんどの細胞型で効率的な配信（皿の中に存在する細胞の90％以上で細胞質ゾルデリバリーのハイレベル）（ 図3）につながります。しかし、より低いまたはより高い濃度の浸透に高いまたは低い傾向を持つ細胞タイプのためのより適切な場合があります。 メディアに関する注：それはdfTAT中のジスルフィド結合を減らすことができるシステインを含んでいないため、NRL-15はdfTATの送達のために使用されます。しかし、我々のデータは、通常のL-15（システイン）及びDMEM両方が送達媒体として使用することができることを示しています。 L-15は、還元アミノ酸システインが、システインpresumabが含まLYは（DMEMがシスチンを用いて製剤化された）、シスチンを形成するために、培地中で酸化します。 dfTATしたがって、これらの媒体内にそのまま残り、配信はnrL15で得られたものと同じ効率で動作します。 </li><li>伴うまたは積荷なしdfTAT（5μM）（ 例えば 、EGFP（10μM））で細胞をインキュベートし、（インキュベーション時間を低減することができるが、dfTATは、典型的には、エンドソームの漏出を誘導するために、約30〜45分を必要とし、1時間37℃で維持）。 </li><li>細胞の細胞膜に結合したdfTATを削除する（3回の洗浄が推奨されている）L-15中のヘパリン（1 mg / ml）で細胞を洗浄。 </li><li>に従ってのSytoxブルー、。 例えば、細胞不透過性の核染色で細胞をインキュベートし、のSytoxグリーン（NRL-15で2μM）、細胞の細胞膜が損なわれているかどうかを判断する（生細胞ではないだろうが、死細胞を染色されます）製造業者のプロトコル。 </li><li>蛍光顕微鏡（100倍の油浸または20X対物レンズ）を用いて、画像セル。 RFPフィルタを用いた画像dfTAT（例=560±20 nmで/エム= 630±35 nm）で。 注：正常配信は（目的のタンパク質またはペプチドの送達を評価する用途に依存する）は、細胞全体dfTAT蛍光の拡散につながります。 fTAT（サイトゾルエントリ時dfTATの還元生成物）による核小体の染色が検出された蛍光が細胞内であることを指標として用いることができます。 fTATは数時間以内に低下します。この時点で、分解フラグメントの蛍光は点状として表示されます。これはdfTATが失敗した（dfTATは濃度が低すぎるで存在する場合、この現象が発生することができます）、エンドソーム内に閉じ込められたまま場合にも見られている点状分布のために混同してはなりません。 </li></ol>配信MOIの5 Controling濃度<ol><li>使用した細胞型におけるdfTATの効率的な細胞質の放出を達成するために必要な「最適な配信」の濃度を特定します。 increasinとインキュベートした細胞に蛍光顕微鏡を実行しますdfTAT gの濃度。最適dfTAT濃度はサイトゾル消去につながる最小濃度として定義されている培養物中の細胞の約100％にTMR蛍光を「拡散します」。 </li><li> （dfTATの最適な送達濃度を用いて、例えば ）dfTAT一定の濃度を維持しながら、MOIの濃度は、共インキュベーションプロトコルで使用される変化します。 1時間未満にインキュベーション時間を変更すると、MOIは、配信の量を変化させるためのオプションであってもよいです。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

これは送達効率に影響を与える可能性があるためdfTAT配信に使用される細胞は、（&gt; 90％の集密度）過度にコンフルエントであってはなりません。細胞はまた、健康でなければなりません：文化の中で死んだ細胞がdfTATは（劣化した核から例えば、DNA）を対話することができるアポトーシス断片を放出することができます。これにより、配信効率及びイメージングの質を妨害すること?...

生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不透過性小分子の送達は、多くの生物学的またはバイオテクノロジー用途（細胞イメージング、機能的アッセイ、細胞の再プログラミングなど ）1-4でしばしば望ましいです。多くの送達アプローチは、既にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはキャリア剤の使用を含め、報告されている（ 例えば 、例えば、TATのような細胞透過性ペプチド、脂質）5-7。各技術は、典型的には、特定のアプリケーションのためではなく、他人のために、これらのアプローチが適切になるかもしれない特定の長所と短所を持っています。一般的な問題は、 例えば （全人口の貧しい配信の効率化および/ ​​または8,9を配信されるどのくらいの材料の制御の欠如、毒性または有害な生理学的影響10,11、時間的制御の欠如、少数の細胞での配信ではなく、を含みます。、マイクロインジェクション）12、および複雑な化学的結合または製剤スキーム11。 S = &quot;jove_contentは&quot;&gt;最近​​、我々はこれらの制限を回避する新たな配信戦略を開発しました。この戦略は、dfTAT（二量体蛍光TAT）13という名前のペプチドに依存しています。 dfTATは周知の細胞透過性ペプチド（CPP）TATに由来します。 dfTATは、フルオロフォアのテトラメチルローダミンで標識TATの2つのジスルフィド結合したコ​​ピーが含まれています。その類似性にもかかわらず、TATおよびdfTAT活動に大きく異なります。 TATは、典型的には、エンドサイトーシスによって細胞内に内在化されます。このCPPは、しかし、大部分（蛍光顕微鏡で検査したとき、これは通常、細胞内ペプチドの点状の分布につながる）、エンドソーム内に閉じ込められたままになります。 TATのように、dfTATを効率的に細胞によってエンドサイトーシスされます。しかし、dfTATはエンドソーム内に閉じ込められたままにしません。その代わりに、それは非常に効率的な方法でエンドソーム漏れを媒介します。 dfTATのエンドソーム溶解活性は、単純なインキュベーションアッセイにより高分子を提供するために活用することができます。 ntentは &quot;&gt;次のように配信プロセスの現在の理解がある。dfTATがマクロピノサイトーシスを誘導する。その結果、dfTATとともにインキュベートした細胞は、流体相によってメディアに存在する可溶性タンパク質、ペプチド、または小分子（目的の分子、MOI）を取り上げますエンドサイトーシス（ 図1参照）。dfTATとMOIの間の相互作用が必要でない両方のエンティティトラフィック限り一緒にエンドサイトーシス経路内。dfTATはエンドサイトーシスの細胞小器官の内腔内の特定のしきい値に達すると、それはそのエンドソーム漏洩活性を発現する（分子の詳細。）完全には特性決定されて漏出性細胞小器官の内腔の内容のままであり、したがってMOIは、その後、細胞内に放出される。MOIとの接合または製剤スキームが必要とされないように、このアプローチは、したがって、非常に便利です。また、dfTATであるため、直接MOIを変更していない細胞内送達が達成されると、それはまたのMOIの機能を妨害してはならない。また、濃度をdfTATは、配信がメディアでMOIのそれとは独立して使用します。例えば、dfTAT濃度がエンドソーム漏れで再現可能な効率を保証するために、異なる実験間で一定に保つことができます。対照的に、培地中のMOIの濃度が徐々にMOIの所望のレベルを達成するために変更することができる細胞質ゾルに送達しました。 dfTATで達成高エンドソーム漏れ効率は、現在までに試験した細胞の多くと非常に無害です。エンドサイトーシス小器官は細胞の重要な構成要素であり、1つはdfTATによって媒介劇的な漏れが有害な細胞応答を伴うことであろうと予想されるので、これは驚きです。しかし、処理された細胞は、未処理の細胞と同じ速度で増殖し、そのトランスクリプトームの有意な変化は表示されません。また、配達は、細胞が失わずに許容されたり、配信プロセスから回復するかことを示し、再現性の配信効率で数分以内に繰り返すことができますエンドサイトーシスまたはエンドソーム漏れ能力。微妙な細胞応答はdfTAT配信およびこれらの応答が探求されないままであるかもしれないものの分子の詳細の間に行わ可能性があります。しかし、高効率、プロトコルの利便性、および毒性の欠如を組み合わせることで、この配信アプローチは、多くの細胞ベースのアプリケーションですぐに有用であることを証明する必要があります。本明細書に提示プロトコルは研究団体にこの技術がアクセス可能にすることを目的としています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Heparin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CAS 9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Blue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S11348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYTOX Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>S7020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nrL15 L-15 (&#8211;) cysteine</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>Special order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected Amino acids</td>
			<td>Novabiochem</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dfTAT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Samples will be provided upon request (contact: pellois@tamu.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety Cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted epifluorescence microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>model IXB1</td>
			<td>equipped with a heating stage maintained at 37 &#176;C and with a Rolera-MGI Plus back-illuminated electron-multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera (Qimaging).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 &#176;C humidified, 5% CO2 incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesizer or vessel to preform manual peptide synthesis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

delivery of proteins, peptides or cell-impermeable small molecules into live cells by incubation with the endosomolytic reagent dftat

高分子送達戦略は、典型的には、細胞侵入経路としてエンドサイトーシス経路を利用します。しかし、エンドソーム捕捉が大幅に細胞の細胞質ゾル空間を貫通巨大分子れる効率を制限します。最近、我々は、試薬dfTAT、蛍光体テトラメチルローダミンで標識されたペプチドTATのジスルフィド結合二量体を識別することによって、この問題を回避しています。我々は、生細胞に浸透し、特に高い効率で細胞の細胞質ゾル空間に到達した原型の細胞透過性ペプチド（CPP）、TAT、dfTATの蛍光標識された二量体を生成しました。 dfTATのサイトゾル送達は初代細胞を含む複数の細胞株において達成されます。また、配達は著しく細胞の生存率、増殖または遺伝子発現に影響を​​与えません。 dfTATは、小分子、ペプチド、抗体、生物学的に活性な酵素や転写因子を提供することができます。本稿では、dfTAに関わるプロトコルを記述T合成および細胞送達。原稿は、細胞外に投与されたタンパク質の量を変化させることによって、細胞の細胞質ゾル空間に送達されるタンパク質の量を制御する方法について説明します。最後に、この新しい技術と配信の検証に必要な手順の現在の限界が議論されています。記載されているプロトコルは、細胞ベースのアッセイのためだけでなく、 細胞のex vivoで操作し、再プログラミングのために非常に有用です。

fTAT dfTATとの間の差を評価するために、HeLa細胞は、その細胞内局在の違いを決定するために、それぞれのペプチドで1時間インキュベートします。 2 CPPのの内在化は、蛍光顕微鏡を用いて評価した。 図2は fTAT（20μM）は点状の分布に局在することを示しています。この分布は、エンドソームの内部に閉じ込められたままのペプチドと一致しています。これとは対照的に、dfTAT（5μM?...

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Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky.

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K ビュー.  Texas A&M University. We describe how to deliver proteins and cell-impermeable small molecules into cultured mammalian cells by a simple co-incubation protocol with a reagent that causes endocytic organelles to become leaky. 

ビデオ: Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

Fabrication of Electrochemical-DNA Biosensors for the Reagentless Detection of Nucleic Acids, Proteins and Small Molecules

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. Many patients would be better served by rapid, bedside tests. To this end our laboratory and others have developed a versatile, reagentless 
biosensor platform that supports the quantitative, reagentless, electrochemical detection of nucleic acids (DNA, RNA), proteins (including antibodies) and small 
molecules analytes directly in unprocessed clinical and environmental samples. In this video, we demonstrate the preparation and use of several biosensors in this 
"E-DNA" class. In particular, we fabricate and demonstrate sensors for the detection of a target DNA sequence in a polymerase chain reaction mixture, an HIV-specific antibody and the drug cocaine. The preparation procedure requires only three hours of hands-on effort followed by an overnight incubation, and their use requires only minutes.

"E-DNA" sensors, reagentless, electrochemical biosensors that perform well even when challenged directly in blood and other complex matrices, have been adapted to the detection of a wide range of nucleic acid, protein and small molecule analytes. Here we present a general procedure for the fabrication and use of such sensors.

核酸、タンパク質と低分子のReagentless検出用電気化学DNAバイオセンサーの作製

As medicine is currently practiced, doctors send specimens to a central laboratory for testing and thus must wait hours or days to 
receive the results. ...

生物工学

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular choice for drug delivery applications, particularly since it is already FDA-approved for use in humans in the form of resorbable sutures. Hydrophobic and hydrophilic drugs are encapsulated in PLGA particles via single- or double-emulsion. Briefly, the drug is dissolved with polymer or emulsified with polymer in an organic phase that is then emulsified with the aqueous phase. After the solvent has evaporated, particles are washed and collected via centrifugation for lyophilization and long term storage. PLGA degrades slowly via hydrolysis in aqueous environments, and encapsulated agents are released over a period of weeks to months. Although PLGA is a material that possesses many advantages for drug delivery, reproducible formation of nanoparticles can be challenging; considerable variability is introduced by the use of different equipment, reagents batch, and precise method of emulsification. Here, we describe in great detail the formation and characterization of microparticles and nanoparticles formed by single- or double-emulsion using the emulsifying agent vitamin E-TPGS. Particle morphology and size are determined with scanning electron microscopy (SEM). We provide representative SEM images for nanoparticles produced with varying emulsifier concentration, as well as examples of imaging artifacts and failed emulsifications. This protocol can be readily adapted to use alternative emulsifiers (e.g. poly(vinyl alcohol), PVA) or solvents (e.g.&#160;dichloromethane, DCM).

We describe the production and characterization of nanoparticles and microparticles composed of poly(lactic-co-glycolic acid) using vitamin E-TPGS as an emulsifier. By varying formulation parameters such as the concentration of emulsifier, it is possible to produce nanoparticles with mean diameters ranging from 220 nm to&#160;1.98 &#181;m.

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

光ピンセットによる単一のRNA分子のナノマニピュレーション

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers that exist in biological fluids cannot be easily detected with mass spectrometry or immunoassays because they are present in very low concentration, are labile, and are often masked by high-abundance proteins such as albumin or immunoglobulin. Bait containing poly(N-isopropylacrylamide) (NIPAm) based nanoparticles are able to overcome these physiological barriers. In one step they are able to capture, concentrate and preserve biomarkers from body fluids. Low-molecular weight analytes enter the core of the nanoparticle and are captured by different organic chemical dyes, which act as high affinity protein baits. The nanoparticles are able to concentrate the proteins of interest by several orders of magnitude. This concentration factor is sufficient to increase the protein level such that the proteins are within the detection limit of current mass spectrometers, western blotting, and immunoassays. Nanoparticles can be incubated with a plethora of biological fluids and they are able to greatly enrich the concentration of low-molecular weight proteins and peptides while excluding albumin and other high-molecular weight proteins. Our data show that a 10,000 fold amplification in the concentration of a particular analyte can be achieved, enabling mass spectrometry and immunoassays to detect previously undetectable biomarkers.

Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.

ハイドロゲルナノ粒子プラズマの収穫や少量のタンパク質を検出するための尿

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Nanoformulated分子の送達を研究するためのモデル：ラット血液脳関門を通過して、FITCロードフェリチンのin vitro浸透で

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors within the medium to control cell behavior. However, soluble additions cannot mimic certain signaling motifs, such as matrix-bound growth factors, cell-cell signaling, and spatial biochemical cues, which are common influences on cells. Furthermore, biophysical properties of the matrix, such as substrate stiffness, play important roles in cell fate, which is not easily manipulated using conventional cell culturing practices. In this method, we describe a straightforward protocol to provide patterned bioactive proteins on synthetic polyethylene glycol (PEG) hydrogels using photochemistry. This platform allows for the independent control of substrate stiffness and spatial biochemical cues. These hydrogels can achieve a large range of physiologically relevant stiffness values. Additionally, the surfaces of these hydrogels can be photopatterned with bioactive peptides or proteins via thiol-ene click chemistry reactions. These methods have been optimized to retain protein function after surface immobilization. This is a versatile protocol that can be applied to any protein or peptide of interest to create a variety of patterns. Finally, cells seeded onto the surfaces of these bioactive hydrogels can be monitored over time as they respond to spatially specific signals.

In this method, we use photopolymerization and click chemistry techniques to create protein or peptide patterns on the surface of polyethylene glycol (PEG) hydrogels, providing immobilized bioactive signals for the study of cellular responses in vitro.

生理活性タンパク質や生物学的応用の光化学ハイドロゲルのペプチドをパターニング

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

Development of Microfluidic Devices to Study the Elongation Capability of Tip-growing Plant Cells in Extremely Small Spaces

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior in such restrictive conditions. To address this issue, we have developed growth chambers for tip-growing plant cells that contain a series of narrow, micro-fabricated gaps (~1 &#181;m) in a poly-dimethylsiloxane (PDMS) substrate. This transparent material allows the user to monitor tip elongation processes in individual cells during microgap penetration by time-lapse imaging. Using this experimental platform, we observed morphological changes in pollen tubes as they penetrated the microgap. We captured the dynamic changes in the shape of a fluorescently labeled vegetative nucleus and sperm cells in a pollen tube during this process. Furthermore, we demonstrated the capability of root hairs and moss protonemata to penetrate the 1 &#181;m gap. This in vitro platform can be used to study how individual cells respond to physically constrained spaces and may provide insights into tip-growth mechanisms.

We describe a method to investigate the capability of tip-growing plant cells, including pollen tubes, root hairs, and moss protonemata, to elongate through extremely narrow gaps (~1 &#181;m) in a microfluidic device.

非常に小さいスペースで先端成長植物細胞の伸長機能を勉強するマイクロ流体デバイスの開発

In vivo, tip-growing plant cells need to overcome a series of physical barriers; however, researchers lack the methodology to visualize cellular behavior ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all variations are based on the 20 canonical amino acids (cAAs). As a way to introduce additional physicochemical properties into polypeptides, the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) is increasingly used in protein engineering. Due to their relatively short length, the modification of ribosomally synthesized and post-translationally modified peptides by ncAAs is particularly attractive. New functionalities and chemical handles can be generated by specific modifications of individual residues. The selective pressure incorporation (SPI) method utilizes auxotrophic host strains that are deprived of an essential amino acid in chemically defined growth media. Several structurally and chemically similar amino acid analogs can then be activated by the corresponding aminoacyl-tRNA synthetase and provide residue-specific cAA(s) &#8594; ncAA(s) substitutions in the target peptide or protein sequence. Although, in the context of the SPI method, ncAAs are also incorporated into the host proteome during the phase of recombinant gene expression, the majority of the cell&#39;s resources are assigned to the expression of the target gene. This enables efficient residue-specific incorporation of ncAAs often accompanied with high amounts of modified target. The presented work describes the in vivo incorporation of six proline analogs into the antimicrobial peptide nisin, a lantibiotic naturally produced by Lactococcus lactis. Antimicrobial properties of nisin can be changed and further expanded during its fermentation and expression in auxotrophic Escherichia coli strains in defined growth media. Thereby, the effects of residue-specific replacement of cAAs with ncAAs can deliver changes in antimicrobial activity and specificity. Antimicrobial activity assays and fluorescence microscopy are used to test the new nisin variants for growth inhibition of a Gram-positive Lactococcus lactis indicator strain. Mass spectroscopy is used to confirm ncAA incorporation in bioactive nisin variants.

The protocol presents the Escherichia coli-based selective pressure incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) into the lactococcal antimicrobial peptide nisin. Its properties can be changed during recombinant expression via substitution with desired ncAAs in defined growth media. Resulting changes in bioactivity are mapped by growth inhibition assays and fluorescence microscopy.

非正規のアミノ酸類の選択的な圧力の取り込みによって生成される抗菌ペプチド

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different infectious diseases. In this article we demonstrate a method to produce a SAPN core containing a six-helix bundle (SHB) assembly that is capable of presenting antigens in a trimeric conformation. We describe the expression of the SHB-SAPN in an E. coli system, as well as the necessary protein purification steps. We included an isopropanol wash step to reduce the residual bacterial lipopolysaccharide. As an indication of the protein identity and purity, the protein reacted with known monoclonal antibodies in Western blot analyses. After refolding, the size of the particles fell in the expected range (20 to 100 nm), which was confirmed by dynamic light scattering, nanoparticle tracking analysis, and transmission electron microscopy. The methodology described here is optimized for the SHB-SAPN, however, with only slight modifications it can be applied to other SAPN constructs. This method is also easily transferable to large scale production for GMP manufacturing for human vaccines.

Production of E. coli-expressed Self-Assembling Protein Nanoparticles for Vaccines Requiring Trimeric Epitope Presentation

A detailed method is provided here describing the purification, refolding, and characterization of self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) for use in vaccine development.

トリマーエピトーププレゼンテーションを必要とするワクチンに対する大腸菌の自己組織化タンパク質ナノ粒子の産生

Self-assembling protein nanoparticles (SAPNs) function as repetitive antigen displays and can be used to develop a wide range of vaccines for different ...