Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области бактериального патогенеза о том, болезнетворные бактерии могут пересечь гемато-мозговой барьер, чтобы заразить центральную нервную систему и мозг. С помощью этого метода, бактериальные номера в крови и мозговой ткани инфицированных животных могут быть определены, исключая количество бактерий, проживающих в кровеносных сосудах мозга. Демонстрацией процедуры будет Паллаб Гош, научный сотрудник из моей лаборатории.
В 72 часа после заражения установите автоматизированную систему перфузии на скорость потока в четыре миллилитров PBS, дополненную 10 миллимолярной ЭДТА в минуту. И поместите усыпляемое животное в положение на спине в кастрюлю для вскрытия. Подтвердите эвтанизацию отсутствием реакции на щепотку лапы.
И мокрый живот с 75%этанола. Используйте ножницы, чтобы сделать разрез брюшной стенки чуть ниже грудной клетки, чтобы разоблачить диафрагму и висцеральные органы. И вырезать диафрагму, чтобы открыть грудную полость.
Вырезать руб клетке на двусторонней основе подвергать левый желудочек и использовать миппы, чтобы мягко схватить сердце. Вставьте 21-калиберную иглу бабочки, соединенную с системой перфузии, в левый желудочек и аккуратно вырежьте правый атриум, чтобы собрать около 200 микролитров крови в двухми миллилитровую трубку, содержащую 10 миллимолярный ЭДТА, чтобы предотвратить коагуляцию. Затем пронизыть животное в течение четырех минут с 15 до 20 миллилитров PBS плюс EDTA.
После полной перфузии, мозг и печень будут появляться бланшированные обеспечения того, чтобы оставшиеся бактерии из собранных органов, а не циркулирующей крови. После перфузии, тщательно передать органы, представляющие интерес в отдельных стерильных, 15-миллилитровых конических труб, содержащих пять миллилитров стерильных четырех градусов по Цельсию PBS на трубку. Чтобы собрать мозг после обезглавливания, используйте ножницы, чтобы сократить кожу головы вниз по средней линии между глазами, сохраняя кончики прижаты к черепу, чтобы обрезать любые избыточные ткани по мере необходимости.
Аккуратно вставьте один кончик ножниц в foramen magnum и вырезать боковой в череп с обеих сторон. Тщательно разрежьте череп между глазами по средней линии черепа, заботясь о применении бокового давления и во избежание возмущения мозга. Используя типсы, откройте череп, чтобы разоблачить мозг и поместите шпатель между нижней частью мозга и основанием черепа, чтобы тщательно перенести мозг в 15-миллилитровую трубку, содержащую пять миллилитров по четыре градуса цельсия PBS.
В шкаф биобезопасности вставьте наконечник и запустите гомогенизатор ткани в течение 10 секунд в последовательных 5%отбеливатель, стерильная вода, 75% этанола, и стерильные водные растворы в отдельных 15-миллилитровых конических труб. Когда кончик был тщательно стерилизован, гомогенизировать инфицированный мозг в его трубке. Когда видимых фрагментов ткани не останется, повторно стерилизовать кончик, чтобы предотвратить бактериальную переноску к следующему образцу органа, и гомогенизировать следующий орган.
Когда все органы были гомогенизированы, подготовить 10-кратное серийное разбавления каждого органа гомогената в стерильных PBS и пластины разбавления на мозг-сердце инфузии агар пластин. Затем инкубировать гомогенат разбавления культур на 37 градусов по Цельсию в одночасье и подсчитать количество колоний на каждой пластине, чтобы определить общее количество бактерий на орган или миллилитр крови. Расчет бактериальной нагрузки в L.monocytogenes инфицированных органов мыши, как только что показали, свидетельствует о том, что перфузия после инфекции не существенно изменить бактериальное бремя в крови или органах инфицированных мышей, которые были рассмотрены в этом репрезентативном исследовании.
После этой процедуры, Листерия моноцитогенов инфицированных органов могут быть дополнительно обработаны для дополнительного анализа, таких как гистопатологическая обработка ответить на дополнительные вопросы о проникновении воспалительных клеток в инфицированных органов мыши по сравнению с неинфицированных животных контроля. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы избежать возмущения мозга и поддерживать минимальный контакт между ножницами и ткани мозга.
