本プロトコルでは、EDUの組み込みと免疫染色の各ステップの詳細な説明を提供するだけでなく、画像取得、画像処理、および大規模データセットを分析するためのヒントを提供します。この手法により、G1、S、M の各相でセルを割り当てることができます。これは、有糸分裂遺伝子に影響を及ぼす非突然変異に関する研究における細胞周期解析に特に有用である。
私たちは、人々がこの技術の事前の知識や経験を持っていない場合、2〜3ヶ月間苦労することを期待します。まず、シュナイダーの解剖培地またはSMを光沢スポットプレートの2つの連続したくぼみに加え、その後のうつ病にPBSを加えます。鉗子のペアを使用して、3番目のインスター幼虫をさまようを選び、フライ食品残渣をきれいにするためにPBSでラットされた組織の上に置きます。
PBSでうつ病に幼虫を入れ、続いてSMを含む連続したうつ病を行う。次に解剖顕微鏡の下で、幼虫の下半身の4分の3を取り除くために細かい鉗子を使用する。その後、そっと鉗子のペアで幼虫の口のフックをつかみ、他の端のキューティクルをもう一方の鉗子で保持します。口のフックを内側に押し込み、同時にもう一方の端の組織を剥がすことによって、幼虫の頭を裏返しにします。
取り付けられた想像力ディスクを持つ幼虫の脳を観察します。脳に取り付けられた他の組織を削除し、SMで後続のうつ病に脳を転送します。.100マイクロモルEDU SM溶液の100マイクロモルEDU SM溶液の100マイクロリットルをパイレックスプレートの別のうつ病に加え、この溶液中の約5〜10の解剖された脳を摂氏25度で2時間インキュベートします。固定および免疫染色後、PBSTを除去し、EDU検出カクテルを解剖した脳に加える。
その後、ニューアテーターの暗闇の中で室温でそれらをインキュベートします。30分後、PBSTで2回、暗い所で10分間洗浄します。DNA染色の場合は、1ミリリットルのHoechst 33342溶液あたり5マイクログラムを調製します。
2回目の洗浄後にPBSTを取り除き、解剖された脳にHoechst溶液の500マイクロリットルを加え、暗闇の中でインキュベートします。10分後、Hoechstを取り出し、PBSTで10分間洗浄します。ラボベンチにチューブをタップし、脳が落ち着くようにします。
チューブからPBSTを取り出し、50~100マイクロリットルを残します。200マイクロピペットチップの端をカットし、きれいなガラススライドに脳を転送するためにそれを使用しています。フィルターペーパーストリップでブロッティングしてスライドからアクセスPBSTを取り除きます。
フィルター用紙が脳に触れないようにしてください。水溶性の非蛍光実装媒体を脳に一滴入れ、腹側神経コードがスライドに面し、ローブが上向きになるように脳を向けます。脳を連続的に画像化しやすいように、脳を単一のファイルに配置します。
脳の上にカバースリップをそっと置き、一晩2〜6度でインキュベートします。取得ソフトウェアから63倍の目標を選択します。取り付けられた脳のすぐ上のカバースリップに浸漬油を一滴入れ、接眼を通して組織を見つけやすくします。
ダッピーHoechst 33342チャンネルを使用して、接眼眼を通して脳を見つけ、ソフトウェアの取得モードに切り替えます。画像Hoechst 33342、アレクサフロア4 8 8、アレクサフロア5 6、8、およびAlexaフロア6 4 7に4チャンネルを設定します。選択した染料励起レーザーとエミッション フィルタを自動的に設定するには、染料アシスタント ツールを使用します。
脳葉全体を包含するような視野を設定する。この税金を0.8ミクロン離して取得することによって、脳ローブの全容を画像化します。イメージ セッションのすべてのイメージを、ドット L I F ライブラリ形式で保存します。
画像解析の場合は、フィジーを開いてドラッグし、LIF ファイルをフィジーにドロップします。スタック表示タブからデータブラウザを選択し、バイオフォーマットプラグインのメモリ管理タブから仮想スタックを使用します。イメージ J.のマルチチャンネル画像を観察します。画像、色、チャンネルツールを使用して、メニューバーからチャンネルの色を変更します。
そして、ミランダ標識神経芽細胞を監視します, 中央脳領域に大きな丸い細胞として表示されます.神経芽細胞を2回数えないように、各神経芽細胞の上に楕円ツールを使用して関心のある領域を描画します。イメージ J メニュー バーから、分析、ツール、および ROI マネージャを選択します。
現在のZセクション内のすべての神経芽細胞をマークし、各セルをマーキングした後にTを押します。現在のZセクションのすべての神経芽細胞がマークされたら、チャネルをpH3およびEDUに変更し、EDU陽性神経芽細胞、pH3陽性神経芽細胞、EDUおよびpH3陽性神経芽細胞、および神経芽細胞の数を手動でカウントします。神経芽細胞とその後のZセクションを検索し、古いROIを削除し、新しいROIを追加して、異なるスタック内の神経芽細胞を数えます。
スプレッドシートを作成し、各ローブの4つのカテゴリすべてに存在する神経芽細胞の割合を計算します。スプレッドシート ソフトウェアを使用して棒グラフを作成し、各カテゴリの神経芽細胞のパーセンテージのプール データを表示します。ミランダ、EDU、およびpH3でマークされた第3のインスター幼虫脳からの中枢脳神経芽細胞がここに示されている。
G1/G0、S、SG2/M、Mの各相にセルを割り当てた。EDU pH3分析では、MMS19の有意に高い割合で、野生型神経芽細胞と比較して、機能神経芽細胞の消失がM相で見られた。MMS19:関数バックグラウンドのMMS19消失におけるeGFP発現は、野生型レベルにM相の細胞の割合を救った。
その後のステップのために損傷した脳を使用しないことが重要です。そして、EDソリューションは、解剖を開始する前に新たに準備する必要があります。この資産は、特定の細胞周期段階の欠陥を識別するための迅速な初期スクリーニングとして使用できます。
その後、特定のフェーズのより詳細な分析を行うことができます。
