Neste protocolo, não apenas fornecemos uma explicação detalhada de cada etapa da incorporação e imunostaining da EDU, mas também explicamos a aquisição de imagens, o processamento de imagens e fornecemos algumas dicas para analisar grandes conjuntos de dados. Essa técnica permite a alocação de células nas fases G1, S e M. Isso será particularmente útil para a análise do ciclo celular em estudos sobre não mutações que afetam genes mitóticos.
Esperamos que as pessoas lutem por dois a três meses se não tiverem conhecimento prévio ou experiência com essa técnica. Para começar, adicione o meio de dissecção de Schneider ou SM a duas depressões consecutivas de uma placa de brilho e adicione PBS à depressão subsequente. Usando um par de fórceps, pegue a terceira larva instar errante e coloque-as em um tecido decotado com PBS para limpar resíduos de alimentos de mosca.
Coloque a larva na depressão com PBS seguida da depressão consecutiva contendo SM. Em seguida, sob um microscópio de dissecção, use fórceps finos para remover três quartos da parte inferior do corpo da larva. Em seguida, pegue suavemente os ganchos de boca larval com um par de fórceps e segure a cutícula da outra extremidade com o outro par de fórceps. Gire a cabeça larval do avesso empurrando os ganchos da boca para dentro e, simultaneamente, descascando o tecido na outra extremidade.
Observe o cérebro larval com discos imagináveis ligados. Remova outros tecidos ligados ao cérebro e transfira o cérebro para a depressão consecutiva subsequente com SM. Adicione 100 microliters de 100 micromolar EDU SM solução para outra depressão na placa Pyrex e incubar aproximadamente 5 a 10 cérebros dissecados nesta solução por 2 horas a 25 graus Celsius. Após fixação e imunostaining remova o PBST e adicione o coquetel de detecção de EDU aos cérebros dissecados.
Em seguida, incuba-los à temperatura ambiente no escuro em um neutater. Após 30 minutos, lave as amostras duas vezes com PBST por 10 minutos por lavagem no escuro. Para coloração de DNA, prepare 5 microgramas por solução mililitro Hoechst 33342.
Remova o PBST após a segunda lavagem e adicione 500 microliters da solução Hoechst aos cérebros dissecados e, em seguida, incuba-os no escuro. Após 10 minutos, retire o Hoechst e lave as amostras com PBST por 10 minutos. Bata o tubo no banco do laboratório e deixe os miolos se acalmarem.
Remova o PBST do tubo, deixando para trás 50 a 100 microlitres. Corte a ponta de um micropipet de 200 microliter e use-o para transferir o cérebro para um escorregador de vidro limpo. Remova o pbst de acesso do slide manchando-o com tiras de papel de filtro.
Não deixe o papel filtro tocar no cérebro. Coloque uma gota de um meio de montagem solúvel em água, não fluorescing no cérebro e oriente os cérebros de tal forma que o fio nervoso ventral enfrente o slide e os lóbulos voltados para cima. Organize o cérebro em um único arquivo para que seja mais fácil imaginar o cérebro em série.
Coloque suavemente um deslizamento de cobertura em cima do cérebro e incubar o slide durante a noite a 2 a 6 graus Celsius. A partir do software de aquisição selecione o objetivo 63 vezes. Coloque uma gota de óleo de imersão na tampa deslize logo acima do cérebro montado para facilitar a localização do tecido através da ocular.
Usando o canal Dappy Hoechst 33342, encontre o cérebro através da ocular e, em seguida, mude para o modo de aquisição no software. Configure 4 canais para imagem Hoechst 33342, Alexa piso 4 8 8, alexa piso 5 6, 8 e alexa piso 64 7. Use a ferramenta assistente de corante para configurar automaticamente os lasers de excitação de corantes selecionados e filtros de emissão.
Defina o campo de visão, de tal forma que engloba todo o lobo cerebral. Imagem de todo o volume do lobo cerebral adquirindo este imposto espaçado 0,8 míclicas separados. Armazene todas as imagens de uma sessão de imagem em um formato de biblioteca ponto L I F.
Para análise de imagem, abra Fiji, arraste e solte os arquivos LIF em Fiji. Selecione o navegador de dados na guia de visualização de pilhas e use pilha virtual na guia de gerenciamento de memória no plugin de formatos biológicos. Observe a imagem multicanal exibida na imagem J.Altere a cor dos canais da barra de menu, usando a ferramenta imagem, cor e canais.
E monitorar os neuroblastos rotulados por Miranda, que aparecem como grandes células redondas na região central do cérebro. Desenhe uma região de interesse usando a ferramenta de elipse sobre cada neuroblasto para evitar contar o neuroblasto duas vezes. Na barra de menu de imagem J, selecione análise, ferramentas e gerenciador de ROI.
Marque todos os neuroblastos na seção Z atual e pressione T após marcar cada célula. Uma vez marcados todos os neuroblastos da atual seção Z, mude os canais para pH3 e EDU e conte manualmente o número de neuroblastos positivos de EDU, neuroblastos positivos pH3, neuroblastos positivos EDU e pH3, e neuroblastos não manchando para nenhum dos marcadores. Procure por neuroblastos e seções Z subsequentes, exclua ROIs antigos e adicione novos ROIs para contar neuroblastos em pilhas diferentes.
Prepare uma planilha e calcule os percentuais de neuroblastos presentes nas quatro categorias para cada lobo. Prepare um gráfico de barras usando o software de planilhas, mostrando os dados de pools para porcentagens de neuroblastos em cada categoria. Neuroblastos cerebrais centrais do terceiro cérebro larval instar marcados com Miranda, EDU e pH3 são mostrados aqui.
As células foram alocadas nas fases G1/G0, S, SG2/M e M. Na análise do pH3 EDU, uma proporção significativamente maior de MMS19, a perda de neuroblastos de função foi encontrada na fase M em comparação com neuroblastos do tipo selvagem. A expressão MMS19:eGFP na perda de fundo de função MMS19 resgatou a proporção de células em fase M para níveis de tipo selvagem.
É importante não usar cérebros danificados para etapas subsequentes. E a solução ED deve ser preparada recentemente antes de iniciar as dissecções. Este ativo pode ser usado como uma triagem inicial rápida para identificar defeitos em fases específicas de ciclo celular.
Isso poderia então ser seguido por uma análise mais detalhada de uma determinada fase.
