이 프로토콜에서는 EDU 통합 및 면역 스테인닝의 각 단계에 대한 자세한 설명을 제공할 뿐만 아니라 이미지 수집, 이미지 처리 설명 및 대규모 데이터 집합 분석을 위한 몇 가지 팁을 제공합니다. 이 기술은 G1, S 및 M 단계에서 셀을 할당할 수 있습니다. 이것은 미토성 유전자에 영향을 미치는 비 돌연변이에 대한 연구 결과에 세포 주기 분석을 위해 특히 유용할 것입니다.
우리는 사람들이 이 기술에 대한 사전 지식이나 경험이 없다면 2~3개월 동안 어려움을 겪을 것으로 기대합니다. 시작하려면, 광택 스팟 플레이트의 두 연속 우울증에 슈나이더의 해부 매체 또는 SM을 추가하고 후속 우울증에 PBS를 추가합니다. 집게 한 켤레를 사용하여, 방황 세 번째 별 애벌레를 선택하고 플라이 음식 잔류물을 청소하기 위해 PBS로 덜린 조직에 배치합니다.
PBS로 우울증에 유충을 두는 다음 SM을 포함하는 연속 우울증이 있습니다. 다음 해부 현미경에서, 애벌레의 하반신의 3 분기를 제거하기 위해 미세 한 집게를 사용합니다. 그런 다음 한 쌍의 포셉으로 애벌레 입 후크를 부드럽게 잡고 다른 쪽 끝의 큐티클을 다른 쪽 끝의 표피를 다른 쪽 끝으로 잡습니다. 입을 안쪽으로 밀어 동시에 다른 쪽 끝에 조직을 벗겨내어 애벌레 머리를 안쪽으로 돌립니다.
부착 된 상상력 디스크와 애벌레 뇌를 관찰. 뇌에 부착 된 다른 조직을 제거하고 SM과 후속 연속 우울증에 뇌를 전송. 100 마이크로리터 100 마이크로리터를 파이렉스 플레이트의 또 다른 우울증에 추가하고 25도에서 2시간 동안 이 솔루션에서 약 5~10개의 해부된 뇌를 배양합니다. 고정 및 면역 염색 후 PBST를 제거하고 해부 된 뇌에 EDU 검출 칵테일을 추가합니다.
그런 다음 호이테이터의 어둠 속에서 실온에서 배양하십시오. 30분 후, 어둠 속에서 세척당 10분 동안 PBST로 샘플을 두 번 씻으시다. DNA 염색을 위해 밀리리터 Hoechst 33342 용액당 5 마이크로그램을 준비하십시오.
두 번째 세척 후 PBST를 제거하고 해부 된 뇌에 Hoechst 용액의 500 마이크로 리터를 추가 한 다음 어둠 속에서 배양하십시오. 10분 후 Hoechst를 제거하고 PBST로 샘플을 10분 동안 세척합니다. 실험실 벤치에 튜브를 누르고 뇌가 정착하자.
튜브에서 PBST를 제거하여 50~100개의 마이크로리터를 남깁니다. 200 마이크로 리터 마이크로 파이프 팁의 끝을 잘라 깨끗한 유리 슬라이드에 뇌를 전송하는 데 사용합니다. 필터 용지 스트립으로 얼룩을 만들어 슬라이드에서 액세스 PBST를 제거합니다.
필터 용지가 뇌에 닿지 않도록 하십시오. 용해성, 비형광 장착 배지를 뇌에 넣고 복부 신경 코드가 슬라이드에 직면하고 로브가 위쪽으로 향하도록 뇌를 방향을 지정합니다. 뇌를 연속적으로 이미지화하는 것이 더 쉬워지도록 두뇌를 단일 파일로 정렬합니다.
조심스럽게 뇌 의 상단에 커버 슬립을 배치하고 2 ~ 6섭씨에서 하룻밤 슬라이드를 배양. 인수 소프트웨어에서 63 배 목표를 선택합니다. 접피스를 통해 조직을 쉽게 찾을 수 있도록 장착 된 뇌 바로 위에 있는 커버 슬립에 침지 오일 한 방울을 넣습니다.
dappy Hoechst 33342 채널을 사용하여, 접피스를 통해 뇌를 찾아 소프트웨어의 획득 모드로 전환. 4 채널 설정 Hoechst 33342, 알렉사 층 4 8 8, 알렉사 층 5 6, 8, 알렉사 바닥 6, 8, 알렉사 바닥 6 4 7. 염료 보조 도구를 사용하여 선택한 염료 여기 레이저 및 방출 필터를 자동으로 설정합니다.
전체 뇌 엽을 포괄하는 시야를 설정합니다. 이 세금을 획득하여 뇌 엽의 전체 볼륨을 이미지 0.8 미크로네 간격. 도트 L I F 라이브러리 형식으로 이미징 세션의 모든 이미지를 저장합니다.
이미지 분석을 위해 피지를 열고 드래그한 다음 LIF 파일을 피지로 놓습니다. 스택 보기 탭에서 데이터 브라우저를 선택하고 바이오 포맷 플러그인의 메모리 관리 탭에서 가상 스택을 사용합니다. 이미지 J.에 표시된 다중 채널 이미지를 관찰하여 이미지, 색상 및 채널 도구를 사용하여 메뉴 표시줄에서 채널의 색상을 변경합니다.
그리고 중앙 뇌 영역에서 큰 둥근 세포로 나타나는 미란다 라벨 신경 폭발을 모니터링할 수 있습니다. 신경 폭발을 두 번 계산하지 않도록 각 신경 폭발위에 타원 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. 이미지 J 메뉴 표시줄에서 분석, 도구 및 ROI 관리자를 선택합니다.
현재 Z 섹션의 모든 신경 아세포에 표시하고 각 세포를 표시 한 후 T를 누릅니다. 현재 Z 섹션의 모든 신경 폭발이 표시되면, pH3 및 EDU로 채널을 변경하고 수동으로 EDU 양성 신경 폭발의 수를 계산, pH3 양성 신경 폭발, EDU 및 pH3 긍정적 인 신경 폭발, 신경 폭발 은 어느 마커에 대한 염색하지. 신경 폭발 및 후속 Z 섹션에 대 한 검색, 오래 된 ROI를 삭제 하 고 다른 스택에 신경 폭발을 계산 하는 새로운 ROI를 추가.
스프레드시트를 준비하고 각 로브에 대해 네 가지 범주 모두에 존재하는 신경 폭발의 백분율을 계산합니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 막대 그래프를 준비하여 각 범주의 신경 폭발 비율에 대한 풀 데이터를 표시합니다. 미란다, EDU 및 pH3로 표시된 세 번째 인스타 애벌레 뇌의 중앙 뇌 신경 폭발이 여기에 표시됩니다.
세포는 G1/G0, S, SG2/M 및 M 상에 할당되었다. EDU pH3 분석에서, MMS19의 상당히 높은 비율, 기능 신경 폭발의 손실은 야생 형 신경 폭발에 비해 M 단계에서 발견되었다. MMS19:eGFP 발현MMS19 기능 배경의 손실은 M 상에서 세포의 비율을 야생 형 수준으로 구출하였다.
후속 단계에 손상된 뇌를 사용하지 않는 것이 중요합니다. 그리고 ED 솔루션은 해부를 시작하기 전에 신선하게 준비해야합니다. 이 자산은 특정 세포 주기 단계에서 결함을 식별하기 위해 빠른 초기 스크리닝으로 사용할 수 있습니다.
그런 다음 특정 단계에 대한 보다 자세한 분석을 통해 후속 조치를 따를 수 있습니다.
