В этом протоколе мы не только предоставляем подробное объяснение каждого этапа включения EDU и иммуноокрашения, но также объясняем получение изображений, обработку изображений и предоставляем некоторые советы по анализу больших наборов данных. Этот метод позволяет распределять клетки в фазах G1, S и M. Это будет особенно полезно для анализа клеточного цикла в исследованиях немутаций, влияющих на митотические гены.
Мы ожидаем, что люди будут бороться в течение двух-трех месяцев, если у них нет предварительных знаний или опыта работы с этой техникой. Для начала добавьте среду рассечения Шнайдера или SM к двум последовательным углублениям глянцевой пятнистой пластины и добавьте PBS к последующему углублению. Используя пару щипцов, соберите блуждающих личинок третьей звезды и поместите их на ткань, обработанную PBS, чтобы очистить остатки пищи мух.
Поместите личинку в депрессию с PBS с последующим последовательным углублением, содержащим SM. Далее под рассеченным микроскопом используйте тонкие щипцы, чтобы удалить три четверти нижней части тела личинки. Затем аккуратно схватите личиночные ртовые крючки одной парой щипцов и удерживайте кутикулу другого конца другой парой щипцов. Выверните личиночную головку наизнанку, выталкивая ротовые крючки внутрь и одновременно отслаивая ткань на другом конце.
Понаблюдайте за личиночным мозгом с прикрепленными воображаемыми дисками. Удалите другие ткани, прикрепленные к мозгу, и переведите мозг к последующей последовательной депрессии с SM. Добавьте 100 микролитров 100 микромолярного раствора EDU SM к другому углублению на пластине Pyrex и инкубируйте примерно от 5 до 10 рассеченных мозгов в этом растворе в течение 2 часов при 25 градусах Цельсия. После фиксации и иммуноокрашивания удалите PBST и добавьте коктейль обнаружения EDU в рассеченный мозг.
Затем инкубируют их при комнатной температуре в темноте на кастрации. Через 30 минут дважды промывайте образцы PBST в течение 10 минут за одну стирку в темноте. Для окрашивания ДНК готовят 5 мкг на миллилитр раствора Hoechst 33342.
Удалите PBST после второй промывки и добавьте 500 микролитров раствора Hoechst в рассеченный мозг, затем высиживаете их в темноте. Через 10 минут удалите Hoechst и промывайте образцы PBST в течение 10 минут. Нажмите трубку на лабораторный стенд и дайте мозгу успокоиться.
Извлеките ПБСТ из трубки, оставив после себя от 50 до 100 микролитров. Вырежьте конец 200-микролитрового наконечника микропипета и используйте его для переноса мозгов на чистую стеклянную горку. Удалите PBST доступа со слайда, промокнув его полосками фильтровальной бумаги.
Не позволяйте фильтровальной бумаге касаться мозгов. Поместите каплю водорастворимой, не флуоресцентной монтажной среды на мозг и сориентируйте мозг так, чтобы вентральный нервный шнур был обращен к скольжению, а лопасти — вверх. Расположите мозг в одном файле, чтобы было легче изображать мозг последовательно.
Осторожно поместите крышку на верхнюю часть мозга и высиживайте слайд в течение ночи при температуре от 2 до 6 градусов по Цельсию. Из программного обеспечения для приобретения выберите цель 63 раза. Положите каплю погружного масла на крышку чуть выше установленных мозгов, чтобы было легче найти ткань через окуляр.
Используя канал dappy Hoechst 33342, найдите мозг через окуляр, а затем переключитесь в режим сбора в программном обеспечении. Настройте 4 канала для изображения Hoechst 33342, Alexa этаж 4 8 8, Alexa этаж 5 6, 8 и Alexa этаж 6 4 7. Используйте инструмент помощника красителя для автоматической настройки выбранных лазеров возбуждения красителей и эмиссионных фильтров.
Установите поле зрения таким образом, чтобы оно охватывало всю долю мозга. Представьте себе весь объем доли мозга, приобретя этот налог на расстоянии 0,8 микрона друг от друга. Храните все изображения из сеанса обработки изображений в формате библиотеки dot L I F.
Для анализа изображений откройте Fiji, затем перетащите файлы LIF на Фиджи. Выберите браузер данных на вкладке просмотра стека и используйте виртуальный стек на вкладке управления памятью в плагине биоформатов. Наблюдайте за многоканальным изображением, отображаемым в изображении J.Измените цвет каналов из строки меню, используя инструмент изображение, цвет и каналы.
И следите за мечеными Мирандой нейробластами, которые выглядят как большие круглые клетки в центральной области мозга. Нарисуйте интересующую область с помощью инструмента эллипса над каждым нейробластом, чтобы избежать подсчета нейробласта дважды. В строке меню J изображения выберите анализ, инструменты и менеджер окупаемости инвестиций.
Отметьте все нейробласты в текущем Z-сечении и нажмите T после маркировки каждой клетки. Как только все нейробласты в текущем Z-сечении будут отмечены, измените каналы на pH3 и EDU и вручную подсчитайте количество EDU-положительных нейробластов, pH3-положительных нейробластов, EDU и pH3-положительных нейробластов и нейробластов, не окрашивающихся ни для одного маркера. Найдите нейробласты и последующие разделы Z, удалите старые ROI и добавьте новые ROI для подсчета нейробластов в разных стеках.
Подготовьте электронную таблицу и рассчитайте процентное содержание нейробластов, присутствующих во всех четырех категориях для каждой доли. Подготовьте гистограмму с помощью программного обеспечения для электронных таблиц, показывая данные пулов для процентов нейробластов в каждой категории. Здесь показаны центральные нейробласты головного мозга из мозга личинок третьей звезды, отмеченные Miranda, EDU и pH3.
Клетки были выделены в фазы G1/G0, S, SG2/M и M. В анализе EDU pH3 была обнаружена значительно более высокая доля MMS19, потеря функции нейробластов в фазе M по сравнению с нейробластами дикого типа. Экспрессия MMS19:eGFP при потере функции MMS19 спасла долю клеток в М-фазе к уровням дикого типа.
Важно не использовать поврежденный мозг для последующих шагов. А раствор ЭД следует приготовить свежим перед началом вскрытия. Этот актив может быть использован в качестве быстрого первоначального скрининга для выявления дефектов в определенных фазах клеточного цикла.
Затем за этим может последовать более подробный анализ конкретного этапа.
