Bu protokolde, sadece EDU şirketleşme ve immünostaining'in her adımının ayrıntılı bir açıklamasını sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda görüntü alımını, görüntü işlemeyi açıklıyor ve büyük veri kümelerini analiz etmek için bazı ipuçları sağlıyoruz. Bu teknik, G1, S ve M fazlarındaki hücrelerin tahsisine izin verir. Bu özellikle mitotik genleri etkileyen mutasyon olmayan çalışmalar üzerinde hücre döngüsü analizi için yararlı olacaktır.
İnsanların bu teknikle ilgili önceden bilgi veya deneyime sahip olmadıkları takdirde iki ila üç ay boyunca mücadele etmesini bekleriz. Başlamak için, Schneider'ın diseksiyon ortamını veya SM'yi parlak bir nokta plakasının ardışık iki çökemine ekleyin ve sonraki depresyona PBS ekleyin. Bir çift toparlama kullanarak, dolaşan üçüncü instar larvalarını seçin ve sinek yiyecek kalıntılarını temizlemek için PBS ile sıçan bir dokuya yerleştirin.
Larvaları PBS ile depresyona yerleştirin ve ardından SM içeren ardışık depresyonu takip edin. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, larvaların alt gövdesinin dörtte üçünü çıkarmak için ince tokmaklar kullanın. Daha sonra larva ağız kancalarını bir çift önsezi ile hafifçe tutun ve diğer ucun manikürini diğer çift asa ile tutun. Ağız kancalarını içe doğru iterek ve aynı anda diğer uçtaki dokuyu soyarak larva başını ters çevirin.
Ekli hayal diskleri ile larva beynini gözlemleyin. Beyne bağlı diğer dokuları çıkarın ve beyni SM ile sonraki ardışık depresyona aktarın. Pyrex plakasındaki başka bir depresyona 100 mikromoler EDU SM çözeltisi ekleyin ve bu çözeltide yaklaşık 5 ila 10 parçalanmış beyni 25 santigrat derecede 2 saat kuluçkaya yatırın. Fiksasyon ve immün yetmezlik sonrası PBST'yi çıkarın ve parçalanmış beyinlere EDU algılama kokteylini ekleyin.
Sonra onları bir nötroter üzerinde karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. 30 dakika sonra, numuneleri PBST ile iki kez karanlıkta yıkama başına 10 dakika yıkayın. DNA boyama için mililitre Hoechst 33342 çözeltisi başına 5 mikrogram hazırlayın.
İkinci yıkamadan sonra PBST'yi çıkarın ve parçalanmış beyinlere 500 mikrolitre Hoechst çözeltisi ekleyin, ardından karanlıkta kuluçkaya yatırın. 10 dakika sonra Hoechst'i çıkarın ve örnekleri PBST ile 10 dakika yıkayın. Tüpü laboratuvar tezgahına dokunun ve beyinlerin yerleşmesine izin verin.
PBST'yi tüpten çıkarın ve arkasında 50 ila 100 mikrolitre bırakın. 200 mikroliter mikropipet ucunun ucunu kesin ve beyinleri temiz bir cam kaydırağa aktarmak için kullanın. Erişim PBST'yi filtre kağıdı şeritleriyle şişirerek slayttan kaldırın.
Filtre kağıdının beyinlere dokunmasına izin vermeyin. Bir damla suda çözünür, floresan olmayan montaj ortamını beyinlere koyun ve beyinleri, ventral sinir kordonu kaydırağa ve loblar yukarı bakacak şekilde yönlendirin. Beyinleri tek bir dosyada düzenleyin, böylece beyinleri seri olarak görüntüleyebilme daha kolaydır.
Beynin üzerine hafifçe bir kapak kayması yerleştirin ve slaytı gece boyunca 2 ila 6 santigrat derecede kuluçkaya bırakın. Satın alma yazılımından 63 kez hedefini seçin. Dokuyu göz merceğinden bulmayı kolaylaştırmak için monte edilmiş beyinlerin hemen üstündeki kapak kaymasına bir damla daldırma yağı koyun.
Dappy Hoechst 33342 kanalını kullanarak beyni göz merceğinden bulun ve ardından yazılımdaki alım moduna geçin. Hoechst 33342, Alexa kat 4 8 8, Alexa kat 5 6, 8 ve Alexa kat 6 4 7'yi görüntülemek için 4 kanal ayarlayın. Seçilen boyaları heyecanlandırma lazerlerini ve emisyon filtrelerini otomatik olarak ayarlamak için boya asistanı aracını kullanın.
Görüş alanını, tüm beyin lobını kapsayacak şekilde ayarlayın. 0,8 mikron aralıklı bu vergiyi alarak beyin lobunun tüm hacmini görüntüleyin. Görüntüleme oturumundaki tüm görüntüleri nokta L I F kitaplık biçiminde depolayın.
Görüntü analizi için Fiji'yi açın, ardından LIF dosyalarını sürükleyip Fiji'ye bırakın. Yığın görüntüleme sekmesinden veri tarayıcısını seçin ve biyo formatlar eklentisinde bellek yönetimi sekmesinden sanal yığın kullanın. Görüntüde görüntülenen çok kanallı görüntüyü gözlemleyin J.Görüntü, renk ve kanallar aracını kullanarak menü çubuğundan kanalların rengini değiştirin.
Miranda etiketli nöroblastları izleyin, orta beyin bölgesinde büyük yuvarlak hücreler olarak görünür. Nöroblast'ı iki kez saymamak için her nöroblast üzerine elips aracını kullanarak ilgi çekici bir bölge çizin. Görüntü J menü çubuğundan analiz, araçlar ve yatırım getirisi yöneticisi'ni seçin.
Mevcut Z bölümündeki tüm nöroblastları işaretleyin ve her hücreyi işaretledikten sonra T tuşuna basın. Mevcut Z bölümündeki tüm nöroblastlar işaretlendikten sonra, kanalları pH3 ve EDU olarak değiştirin ve EDU pozitif nöroblastların, pH3 pozitif nöroblastların, EDU ve pH3 pozitif nöroblastların ve nöroblastların sayısını manuel olarak sayın. Nöroblastları ve sonraki Z bölümlerini arayın, eski ROI'leri silin ve farklı yığınlardaki nöroblastları saymak için yeni ROI'ler ekleyin.
Bir elektronik tablo hazırlayın ve her lob için dört kategoride de bulunan nöroblastların yüzdelerini hesaplayın. Her kategorideki nöroblastların yüzdeleri için havuz verilerini gösteren elektronik tablo yazılımını kullanarak bir çubuk grafik hazırlayın. Miranda, EDU ve pH3 ile işaretlenmiş üçüncü instar larva beyinlerinden merkezi beyin nöroblastları burada gösterilmiştir.
Hücreler G1/G0, S, SG2/M ve M evrelerine ayrıldı. MMS19'un anlamlı derecede daha yüksek bir oranı olan EDU pH3 analizinde, M fazında vahşi tip nöroblastlara kıyasla fonksiyon nöroblast kaybı bulunmuştur. MMS19:EGFP ifadesi MMS19 fonksiyon arka plan kaybı, M fazındaki hücrelerin vahşi tip düzeylerine oranını kurtardı.
Sonraki adımlar için hasarlı beyinleri kullanmamak önemlidir. Ve ED çözeltisi diseksiyonlara başlamadan önce taze olarak hazırlanmalıdır. Bu varlık, belirli hücre döngüsü aşamalarındaki kusurları tanımlamak için hızlı bir ilk tarama olarak kullanılabilir.
Bu daha sonra belirli bir aşamanın daha ayrıntılı bir analizi ile takip edilebilir.
