In questo protocollo, non solo forniamo una spiegazione dettagliata di ogni fase dell'incorporazione e dell'immunocolorazione EDU, ma spieghiamo anche l'acquisizione delle immagini, l'elaborazione delle immagini e forniamo alcuni suggerimenti per l'analisi di set di dati di grandi dimensioni. Questa tecnica consente l'allocazione delle cellule nelle fasi G1, S e M. Ciò sarà particolarmente utile per l'analisi del ciclo cellulare su studi su non mutazioni che colpiscono i geni mitotici.
Ci aspetteremmo che le persone lottino per due o tre mesi se non hanno conoscenze o esperienze precedenti con questa tecnica. Per iniziare, aggiungi il mezzo di dissezione o SM di Schneider a due depressioni consecutive di una piastra spot lucida e aggiungi PBS alla depressione successiva. Usando un paio di pinze, scegli le larve di terza stella vaganti e posizionale su un tessuto ratto con PBS per pulire i residui di cibo della mosca.
Posizionare la larva nella depressione con PBS seguita dalla depressione consecutiva contenente SM. Successivamente, al microscopio di dissezione, utilizzare una pinza fine per rimuovere tre quarti della parte inferiore del corpo della larva. Quindi afferrare delicatamente i ganci della bocca larvale con un paio di pinze e tenere la cuticola dell'altra estremità con l'altro paio di pinze. Ruotare la testa larvale verso l'esterno spingendo i ganci della bocca verso l'interno e contemporaneamente staccando il tessuto all'altra estremità.
Osserva il cervello larvale con dischi immaginali attaccati. Rimuovere altri tessuti attaccati al cervello e trasferire il cervello alla successiva depressione consecutiva con SM. Aggiungere 100 microlitri di 100 micromolari EDU SM soluzione a un'altra depressione sulla piastra Pyrex e incubare circa 5-10 cervelli sezionati in questa soluzione per 2 ore a 25 gradi Celsius. Dopo la fissazione e l'immunocolorazione rimuovere PBST e aggiungere il cocktail di rilevamento EDU al cervello sezionato.
Quindi incubarli a temperatura ambiente al buio su un neutater. Dopo 30 minuti, lavare i campioni due volte con PBST per 10 minuti per lavaggio al buio. Per la colorazione del DNA, preparare 5 microgrammi per millilitro di soluzione di Hoechst 33342.
Rimuovere PBST dopo il secondo lavaggio e aggiungere 500 microlitri della soluzione di Hoechst al cervello sezionato, quindi incubarli al buio. Dopo 10 minuti, rimuovere l'Hoechst e lavare i campioni con PBST per 10 minuti. Tocca il tubo sul banco di laboratorio e lascia che il cervello si stabilizzi.
Rimuovere il PBST dal tubo, lasciando dietro di sé da 50 a 100 microlitri. Tagliare l'estremità di una punta di microtubetto da 200 microlitri e usarla per trasferire il cervello su un vetrino pulito. Rimuovere l'accesso PBST dalla diapositiva tamponandola con strisce di carta da filtro.
Non lasciare che la carta da filtro tocchi il cervello. Metti una goccia di un mezzo di montaggio solubile in acqua e non fluorescente sul cervello e orienta il cervello in modo tale che il cordone nervoso ventrale sia rivolto verso lo scivolo e i lobi rivolti verso l'alto. Disporre i cervelli in un unico file in modo che sia più facile visualizzare il cervello in serie.
Posizionare delicatamente una copertura sulla parte superiore del cervello e incubare la diapositiva durante la notte a 2-6 gradi Celsius. Dal software di acquisizione selezionare l'obiettivo 63 volte. Metti una goccia di olio per immersione sul coperchio appena sopra il cervello montato per rendere più facile individuare il tessuto attraverso l'oculare.
Utilizzando il canale dappy Hoechst 33342, trova il cervello attraverso l'oculare e quindi passa alla modalità di acquisizione nel software. Imposta 4 canali per l'immagine hoechst 33342, Alexa piano 4 8 8, Alexa piano 5 6, 8 e Alexa piano 6 4 7. Utilizzare lo strumento dye assistant per impostare automaticamente i laser di eccitazione dei coloranti selezionati e i filtri di emissione.
Imposta il campo visivo, in modo tale che comprenda l'intero lobo cerebrale. Immagina l'intero volume del lobo cerebrale acquisendo questa tassa distanziata di 0,8 micron l'una dall'altra. Memorizza tutte le immagini di una sessione di imaging in un formato di libreria punto L I F.
Per l'analisi delle immagini, apri Fiji, quindi trascina e rilascia i file LIF in Fiji. Seleziona il browser dei dati dalla scheda di visualizzazione dello stack e utilizza lo stack virtuale dalla scheda di gestione della memoria nel plug-in dei formati bio. Osservare l'immagine multicanale visualizzata nell'immagine J.Modificare il colore dei canali dalla barra dei menu, utilizzando lo strumento immagine, colore e canali.
E monitorare i neuroblasti marcati Miranda, che appaiono come grandi cellule rotonde nella regione centrale del cervello. Disegna una regione di interesse usando lo strumento ellisse su ciascun neuroblasto per evitare di contare il neuroblasto due volte. Dalla barra dei menu dell'immagine J, selezionare analizza, strumenti e ROI manager.
Contrassegnare tutti i neuroblasti nella sezione Z corrente e premere T dopo aver contrassegnato ogni cellula. Una volta che tutti i neuroblasti nell'attuale sezione Z sono marcati, cambiare i canali in pH3 ed EDU e contare manualmente il numero di neuroblasti EDU positivi, neuroblasti pH3 positivi, neuroblasti EDU e pH3 positivi e neuroblasti non macchiati per nessuno dei due marcatori. Cerca i neuroblasti e le sezioni Z successive, elimina i vecchi ROI e aggiungi nuovi ROI per contare i neuroblasti in diversi stack.
Preparare un foglio di calcolo e calcolare le percentuali di neuroblasti presenti in tutte e quattro le categorie per ciascun lobo. Prepara un grafico a barre utilizzando il software per fogli di calcolo, mostrando i dati dei pool per le percentuali di neuroblasti in ogni categoria. I neuroblasti cerebrali centrali del cervello larvale terzo instar contrassegnati con Miranda, EDU e pH3 sono mostrati qui.
Le celle sono state assegnate alle fasi G1/G0, S, SG2/M e M. Nell'analisi EDU pH3, una percentuale significativamente più alta di MMS19, i neuroblasti di perdita di funzione sono stati trovati nella fase M rispetto ai neuroblasti wild type. L'espressione MMS19:eGFP nello sfondo della perdita di funzione MMS19 ha salvato la proporzione di cellule in fase M a livelli wild type.
È importante non usare cervelli danneggiati per i passaggi successivi. E la soluzione ED deve essere preparata appena prima di iniziare le dissezioni. Questa risorsa può essere utilizzata come un rapido screening iniziale per identificare i difetti in specifiche fasi del ciclo cellulare.
Questo potrebbe quindi essere seguito da un'analisi più dettagliata di una particolare fase.
