En este protocolo, no solo proporcionamos una explicación detallada de cada paso de la incorporación de EDU y la inmunotinción, sino que también explicamos la adquisición de imágenes, el procesamiento de imágenes y proporcionamos algunos consejos para analizar grandes conjuntos de datos. Esta técnica permite la asignación de células en fases G1, S y M. Esto será particularmente útil para el análisis del ciclo celular en estudios sobre no mutaciones que afectan a genes mitóticos.
Esperaríamos que las personas luchen durante dos o tres meses si no tienen conocimientos previos o experiencia con esta técnica. Para comenzar, agregue el medio de disección de Schneider o SM a dos depresiones consecutivas de una placa de punto brillante y agregue PBS a la depresión posterior. Usando un par de fórceps, recoja las larvas errantes del tercer instar y colóquelas en un tejido con PBS para limpiar los residuos de alimentos para moscas.
Coloque la larva en la depresión con PBS seguido de la depresión consecutiva que contiene SM. A continuación, bajo un microscopio de disección, use fórceps finos para eliminar tres cuartas partes de la parte inferior del cuerpo de la larva. Luego agarre suavemente los ganchos bucales larvales con un par de fórceps y sostenga la cutícula del otro extremo con el otro par de fórceps. Gire la cabeza de la larva al revés empujando los ganchos de la boca hacia adentro y simultáneamente despegando el tejido en el otro extremo.
Observe el cerebro larvario con discos imaginales adjuntos. Elimine otros tejidos unidos al cerebro y transfiera el cerebro a la posterior depresión consecutiva con SM. Agregue 100 microlitros de solución micromolar EDU SM de 100 a otra depresión en la placa Pyrex e incube aproximadamente de 5 a 10 cerebros disecados en esta solución durante 2 horas a 25 grados Centígrados. Después de la fijación y la inmunotinción, elimine el PBST y agregue el cóctel de detección de EDU a los cerebros disecados.
Luego incube a temperatura ambiente en la oscuridad en un castrativo. Después de 30 minutos, lave las muestras dos veces con PBST durante 10 minutos por lavado en la oscuridad. Para la tinción de ADN, prepare 5 microgramos por mililitro de solución Hoechst 33342.
Retire el PBST después del segundo lavado y agregue 500 microlitros de la solución de Hoechst a los cerebros disecados, luego incube en la oscuridad. Después de 10 minutos, retire el Hoechst y lave las muestras con PBST durante 10 minutos. Golpee el tubo en el banco del laboratorio y deje que los cerebros se asienten.
Retire el PBST del tubo, dejando atrás de 50 a 100 microlitros. Corte el extremo de una punta de micropipeta de 200 microlitros y úsela para transferir los cerebros a un portaobjetos de vidrio limpio. Elimine el PBST de acceso de la diapositiva borrándola con tiras de papel de filtro.
No deje que el papel de filtro toque los cerebros. Coloque una gota de un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente en los cerebros y oriente los cerebros de tal manera que el cordón nervioso ventral se enfrente al tobogán y los lóbulos hacia arriba. Organice los cerebros en un solo archivo para que sea más fácil obtener imágenes de los cerebros en serie.
Coloque suavemente un resbalón de cubierta en la parte superior del cerebro e incube el tobogán durante la noche a 2 a 6 grados centígrados. Desde el software de adquisición seleccione el objetivo de 63 veces. Coloque una gota de aceite de inmersión en el resbalón de la cubierta justo encima de los cerebros montados para facilitar la localización del tejido a través del ocular.
Usando el canal dappy Hoechst 33342, encuentre el cerebro a través del ocular y luego cambie al modo de adquisición en el software. Configure 4 canales para obtener imágenes de Hoechst 33342, Alexa floor 4 8 8, Alexa floor 5 6, 8 y Alexa floor 6 4 7. Utilice la herramienta asistente de tinte para configurar automáticamente los láseres de excitación de tintes y los filtros de emisión seleccionados.
Establezca el campo de visión, de modo que abarque todo el lóbulo del cerebro. Imagine todo el volumen del lóbulo cerebral adquiriendo este impuesto espaciado 0,8 micras de distancia. Almacene todas las imágenes de una sesión de imágenes en un formato de biblioteca de puntos L I F.
Para el análisis de imágenes, abra Fiji, luego arrastre y suelte los archivos LIF en Fiji. Seleccione el navegador de datos en la pestaña de visualización de la pila y use la pila virtual desde la pestaña de administración de memoria en el complemento de formatos biológicos. Observe la imagen multicanal que se muestra en la imagen J.Cambie el color de los canales desde la barra de menús, utilizando la herramienta imagen, color y canales.
Y monitoree los neuroblastos marcados con Miranda, que aparecen como células redondas grandes en la región central del cerebro. Dibuje una región de interés usando la herramienta de elipse sobre cada neuroblasto para evitar contar el neuroblasto dos veces. En la barra de menús de la imagen J, seleccione analizar, herramientas y administrador de ROI.
Marque todos los neuroblastos en la sección Z actual y presione T después de marcar cada célula. Una vez que todos los neuroblastos en la sección Z actual estén marcados, cambie los canales a pH3 y EDU y cuente manualmente el número de neuroblastos EDU positivos, neuroblastos positivos de pH3, neuroblastos positivos de EDU y pH3, y neuroblastos que no se tiñen para ninguno de los marcadores. Busque neuroblastos y secciones Z posteriores, elimine ROI antiguos y agregue nuevos ROI para contar neuroblastos en diferentes pilas.
Prepare una hoja de cálculo y calcule los porcentajes de neuroblastos presentes en las cuatro categorías para cada lóbulo. Prepare un gráfico de barras utilizando el software de hojas de cálculo, mostrando los datos de las agrupaciones para los porcentajes de neuroblastos en cada categoría. Aquí se muestran los neuroblastos cerebrales centrales de los cerebros larvales del tercer instar marcados con Miranda, EDU y pH3.
Las células se asignaron a las fases G1/G0, S, SG2/M y M. En el análisis edu de pH3, se encontró una proporción significativamente mayor de MMS19, pérdida de neuroblastos funcionales en la fase M en comparación con los neuroblastos de tipo salvaje. La expresión MMS19:eGFP en el fondo de pérdida de función MMS19 rescató la proporción de células en fase M a niveles de tipo salvaje.
Es importante no usar cerebros dañados para los pasos posteriores. Y la solución para la disfunción eréctil debe prepararse recién antes de comenzar las disecciones. Este activo se puede utilizar como un cribado inicial rápido para identificar defectos en fases específicas del ciclo celular.
Esto podría ser seguido por un análisis más detallado de una fase en particular.
