Dans ce protocole, nous fournissons non seulement une explication détaillée de chaque étape de l’incorporation et de l’immunocoloration de l’EDU, mais nous expliquons également l’acquisition d’images, le traitement d’images et fournissons quelques conseils pour analyser de grands ensembles de données. Cette technique permet l’allocation des cellules en phases G1, S et M. Cela sera particulièrement utile pour l’analyse du cycle cellulaire sur les études sur les non-mutations affectant les gènes mitotiques.
Nous nous attendrions à ce que les gens luttent pendant deux à trois mois s’ils n’ont pas de connaissances ou d’expérience préalables avec cette technique. Pour commencer, ajoutez le milieu de dissection de Schneider ou SM à deux dépressions consécutives d’une plaque de tache brillante et ajoutez PBS à la dépression suivante. À l’aide d’une paire de pinces, cueillez les larves errantes du troisième stade et placez-les sur un tissu recouvert de PBS pour nettoyer les résidus de nourriture des mouches.
Placez la larve dans la dépression avec PBS suivie de la dépression consécutive contenant du SM. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez une pince fine pour enlever les trois quarts du bas du corps de la larve. Ensuite, attrapez doucement les crochets de la bouche larvaire avec une paire de pinces et tenez la cuticule de l’autre extrémité avec l’autre paire de pinces. Tournez la tête larvaire à l’envers en poussant les crochets buccaux vers l’intérieur et en décollant simultanément le tissu à l’autre extrémité.
Observez le cerveau larvaire avec des disques imaginaux attachés. Enlevez d’autres tissus attachés au cerveau et transférez le cerveau à la dépression consécutive subséquente avec SM. Ajouter 100 microlitres de 100 micromolaires EDU SM solution à une autre dépression sur la plaque de Pyrex et incuber environ 5 à 10 cerveaux disséqués dans cette solution pendant 2 heures à 25 degrés Celsius. Après la fixation et l’immunocoloration, retirez le PBST et ajoutez le cocktail de détection EDU aux cerveaux disséqués.
Ensuite, incubez-les à température ambiante dans l’obscurité sur un neutater. Après 30 minutes, lavez les échantillons deux fois avec du PBST pendant 10 minutes par lavage dans l’obscurité. Pour la coloration de l’ADN, préparez 5 microgrammes par millilitre de solution Hoechst 33342.
Retirez le PBST après le deuxième lavage et ajoutez 500 microlitres de la solution Hoechst aux cerveaux disséqués, puis incubez-les dans l’obscurité. Après 10 minutes, retirez le Hoechst et lavez les échantillons avec du PBST pendant 10 minutes. Tapotez le tube sur le banc de laboratoire et laissez les cerveaux s’installer.
Retirez le PBST du tube, en laissant derrière lui 50 à 100 microlitres. Coupez l’extrémité d’une pointe de micropipet de 200 microlitres et utilisez-la pour transférer le cerveau sur une lame de verre propre. Retirez le PBST d’accès de la diapositive en l’épongeant avec des bandes de papier filtre.
Ne laissez pas le papier filtre toucher le cerveau. Mettez une goutte d’un milieu de montage soluble dans l’eau et non fluorescent sur le cerveau et orientez le cerveau de manière à ce que le cordon nerveux ventral fasse face à la glissière et que les lobes soient tournés vers le haut. Organisez les cerveaux dans un seul fichier afin qu’il soit plus facile d’imager les cerveaux en série.
Placez doucement un couvercle sur le dessus du cerveau et incubez la lame pendant la nuit à 2 à 6 degrés Celsius. Dans le logiciel d’acquisition, sélectionnez l’objectif 63 fois. Mettez une goutte d’huile d’immersion sur le couvercle juste au-dessus des cerveaux montés pour faciliter la localisation du tissu à travers l’oculaire.
À l’aide du canal Hoechst 33342, trouvez le cerveau à travers l’oculaire, puis passez en mode d’acquisition dans le logiciel. Configurez 4 canaux pour imager Hoechst 33342, Alexa étage 4 8 8, Alexa étage 5 6, 8 et Alexa étage 6 4 7. Utilisez l’outil d’assistant de teinture pour configurer automatiquement les lasers d’excitation de colorants et les filtres d’émission sélectionnés.
Réglez le champ de vision de manière à englober tout le lobe du cerveau. Imagez tout le volume du lobe cérébral en acquérant cette taxe espacée de 0,8 micron. Stockez toutes les images d’une session d’imagerie dans un format de bibliothèque point L I F.
Pour l’analyse d’images, ouvrez Fidji, puis faites glisser et déposez les fichiers LIF dans Fidji. Sélectionnez le navigateur de données dans l’onglet d’affichage de la pile et utilisez la pile virtuelle dans l’onglet Gestion de la mémoire dans le plug-in bio formats. Observez l’image multicouche affichée dans l’image J.Modifiez la couleur des couches à partir de la barre de menus, à l’aide de l’outil Image, couleur et couches.
Et surveillez les neuroblastes marqués Miranda, qui apparaissent comme de grandes cellules rondes dans la région centrale du cerveau. Dessinez une région d’intérêt à l’aide de l’outil d’ellipse sur chaque neuroblaste pour éviter de compter le neuroblaste deux fois. Dans la barre de menus de l’image J, sélectionnez Analyser, Outils et Gestionnaire de retour sur investissement.
Marquez tous les neuroblastes dans la section Z actuelle et appuyez sur T après avoir marqué chaque cellule. Une fois que tous les neuroblastes de la section Z actuelle sont marqués, changez les canaux en pH3 et EDU et comptez manuellement le nombre de neuroblastes EDU positifs, de neuroblastes pH3 positifs, de neuroblastes EDU et pH3 positifs et de neuroblastes ne colorant aucun marqueur. Recherchez les neuroblastes et les sections Z suivantes, supprimez les anciens ROI et ajoutez de nouveaux ROI pour compter les neuroblastes dans différentes piles.
Préparez une feuille de calcul et calculez les pourcentages de neuroblastes présents dans les quatre catégories pour chaque lobe. Préparez un graphique à barres à l’aide du logiciel de feuilles de calcul, montrant les données des pools pour les pourcentages de neuroblastes dans chaque catégorie. Les neuroblastes cérébraux centraux des cerveaux larvaires du troisième stade marqués de Miranda, EDU et pH3 sont montrés ici.
Les cellules ont été attribuées aux phases G1/G0, S, SG2/M et M. Dans l’analyse EDU pH3, une proportion significativement plus élevée de MMS19, perte de fonction neuroblastes a été trouvée dans la phase M par rapport aux neuroblastes de type sauvage. MMS19: L’expression eGFP dans le fond de perte de fonction MMS19 a sauvé la proportion de cellules en phase M à des niveaux de type sauvage.
Il est important de ne pas utiliser des cerveaux endommagés pour les étapes suivantes. Et la solution ED doit être préparée fraîchement avant de commencer les dissections. Cet actif peut être utilisé comme un dépistage initial rapide pour identifier les défauts dans des phases spécifiques du cycle cellulaire.
Cela pourrait ensuite être suivi d’une analyse plus détaillée d’une phase particulière.
