In diesem Protokoll geben wir nicht nur eine detaillierte Erklärung zu jedem Schritt der EDU-Integration und Immunfärbung, sondern erklären auch die Bildaufnahme, Bildverarbeitung und geben einige Tipps zur Analyse großer Datensätze. Diese Technik ermöglicht die Zuordnung von Zellen in G1-, S- und M-Phasen. Dies wird besonders nützlich für die Zellzyklusanalyse von Studien über Nicht-Mutationen sein, die mitotische Gene betreffen.
Wir würden erwarten, dass Menschen zwei bis drei Monate kämpfen, wenn sie keine Vorkenntnisse oder Erfahrungen mit dieser Technik haben. Fügen Sie zunächst Schneiders Dissektionsmedium oder SM zu zwei aufeinanderfolgenden Vertiefungen einer Glanzfleckplatte hinzu und fügen Sie PBS zur nachfolgenden Vertiefung hinzu. Pflücken Sie mit einer Pinzette wandernde Larven im dritten Stadium und legen Sie sie auf ein mit PBS rattertes Gewebe, um Fliegennahrungsrückstände zu entfernen.
Platzieren Sie die Larve in der Depression mit PBS, gefolgt von der aufeinanderfolgenden Depression, die SM enthält. Als nächstes unter einem Dissektionsmikroskop verwenden Sie eine feine Pinzette, um drei Viertel des Unterkörpers der Larve zu entfernen. Greifen Sie dann vorsichtig die Larvenmaulhaken mit einer Pinzette und halten Sie die Nagelhaut des anderen Endes mit der anderen Pinzette. Drehen Sie den Larvenkopf von innen nach außen, indem Sie die Mundhaken nach innen drücken und gleichzeitig das Gewebe am anderen Ende abziehen.
Beobachten Sie das Larvengehirn mit angeschlossenen imaginären Bandscheiben. Entfernen Sie andere Gewebe, die am Gehirn befestigt sind, und übertragen Sie das Gehirn auf die nachfolgende aufeinanderfolgende Depression mit SM. Fügen Sie 100 Mikroliter 100 mikromolare EDU SM-Lösung zu einer anderen Vertiefung auf der Pyrexplatte hinzu und inkubieren Sie etwa 5 bis 10 sezierte Gehirne in dieser Lösung für 2 Stunden bei 25 Grad Celsius. Nach der Fixierung und Immunfärbung entfernen Sie PBST und fügen Sie den EDU-Erkennungscocktail zu den sezierten Gehirnen hinzu.
Dann inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur im Dunkeln auf einem Neutater. Nach 30 Minuten waschen Sie die Proben zweimal mit PBST für 10 Minuten pro Wäsche im Dunkeln. Bereiten Sie für die DNA-Färbung 5 Mikrogramm pro Milliliter Hoechst 33342-Lösung vor.
Entfernen Sie PBST nach der zweiten Wäsche und geben Sie 500 Mikroliter der Hoechst-Lösung zu den sezierten Gehirnen, dann inkubieren Sie sie im Dunkeln. Nach 10 Minuten den Hoechst entfernen und die Proben 10 Minuten lang mit PBST waschen. Tippen Sie mit der Röhre auf die Laborbank und lassen Sie das Gehirn zur Ruhe kommen.
Entfernen Sie das PBST aus der Röhre und lassen Sie 50 bis 100 Mikroliter zurück. Schneiden Sie das Ende einer 200 Mikroliter-Mikropipet-Spitze ab und übertragen Sie damit das Gehirn auf einen sauberen Glasobjektträger. Entfernen Sie Access PBST von der Folie, indem Sie sie mit Filterpapierstreifen löschen.
Lassen Sie das Filterpapier nicht das Gehirn berühren. Geben Sie einen Tropfen eines wasserlöslichen, nicht fluoreszierenden Montagemediums auf das Gehirn und richten Sie das Gehirn so aus, dass der ventrale Nervenstrang dem Objektträger zugewandt ist und die Lappen nach oben zeigen. Ordnen Sie die Gehirne in einer einzigen Datei an, so dass es einfacher ist, die Gehirne seriell abzubilden.
Legen Sie vorsichtig einen Deckverschluss auf das Gehirn und inkubieren Sie den Rutsch über Nacht bei 2 bis 6 Grad Celsius. Wählen Sie aus der Erfassungssoftware das 63-fache Ziel aus. Geben Sie einen Tropfen Tauchöl auf den Deckzettel direkt über den montierten Gehirnen, um das Gewebe durch das Okular leichter zu lokalisieren.
Mit dem dappy Hoechst 33342 Kanal, finden Sie das Gehirn durch das Okular und wechseln Dann in den Erfassungsmodus in der Software. Richten Sie 4 Kanäle ein, um Hoechst 33342, Alexa Floor 4 8 8, Alexa Floor 5 6, 8 und Alexa Floor 6 4 7 abzubilden. Verwenden Sie das Farbstoffassistent-Tool, um die ausgewählten Farbstoff-Anregungslaser und Emissionsfilter automatisch einzurichten.
Stellen Sie das Sichtfeld so ein, dass es den gesamten Gehirnlappen umfasst. Stellen Sie sich das gesamte Volumen des Gehirnlappens vor, indem Sie diese Steuer im Abstand von 0,8 Mikrometern erfassen. Speichern Sie alle Bilder aus einer Imaging-Sitzung in einem dot L I F-Bibliotheksformat.
Und überwachen Sie die Miranda-markierten Neuroblasten, die als große runde Zellen in der zentralen Hirnregion erscheinen. Zeichne eine Region von Interesse mit dem Ellipsenwerkzeug über jeden Neuroblasten, um zu vermeiden, dass der Neuroblast zweimal gezählt wird. Wählen Sie in der Menüleiste von Image J die Option Analyze, Tools und ROI Manager aus.
Markieren Sie alle Neuroblasten im aktuellen Z-Abschnitt und drücken Sie T, nachdem Sie jede Zelle markiert haben. Sobald alle Neuroblasten im aktuellen Z-Abschnitt markiert sind, ändern Sie die Kanäle auf pH3 und EDU und zählen Sie manuell die Anzahl der EDU-positiven Neuroblasten, pH3-positiven Neuroblasten, EDU- und pH3-positiven Neuroblasten und Neuroblasten, die für keinen Marker färben. Suchen Sie nach Neuroblasten und nachfolgenden Z-Abschnitten, löschen Sie alte ROIs und fügen Sie neue ROIs hinzu, um Neuroblasten in verschiedenen Stacks zu zählen.
Bereiten Sie eine Tabelle vor und berechnen Sie den Prozentsatz der Neuroblasten, die in allen vier Kategorien für jeden Lappen vorhanden sind. Bereiten Sie mit der Tabellenkalkulationssoftware ein Balkendiagramm vor, das die Pooldaten für den Prozentsatz der Neuroblasten in jeder Kategorie anzeigt. Zentralhirn-Neuroblasten aus Larvenhirnen des dritten Stadiums, die mit Miranda, EDU und pH3 markiert sind, sind hier dargestellt.
Die Zellen wurden den Phasen G1/G0, S, SG2/M und M zugeordnet. In der EDU-pH3-Analyse wurde ein signifikant höherer Anteil von MMS19-Funktionsverlust-Neuroblasten in der M-Phase im Vergleich zu Wildtyp-Neuroblasten gefunden. Die MMS19:eGFP-Expression im MMS19-Funktionsverlusthintergrund rettete den Anteil der Zellen in der M-Phase auf Wildtypniveau.
Es ist wichtig, keine beschädigten Gehirne für nachfolgende Schritte zu verwenden. Und ED-Lösung sollte frisch zubereitet werden, bevor mit der Dissektion begonnen wird. Dieses Asset kann als schnelles erstes Screening verwendet werden, um Defekte in bestimmten Zellzyklusphasen zu identifizieren.
Darauf könnte dann eine detailliertere Analyse einer bestimmten Phase folgen.
