בפרוטוקול זה, אנו לא רק מספקים הסבר מפורט על כל שלב של שילוב EDU וחיסון, אלא גם מסבירים רכישת תמונה, עיבוד תמונה, ומספקים כמה טיפים לניתוח ערכות נתונים גדולות. טכניקה זו מאפשרת הקצאת תאים בשלבי G1, S ו- M. זה יהיה שימושי במיוחד עבור ניתוח מחזור התא על מחקרים על מוטציות שאינן המשפיעות על גנים מיוטיים.
היינו מצפים מאנשים להיאבק במשך חודשיים עד שלושה חודשים אם אין להם ידע או ניסיון קודם עם טכניקה זו. כדי להתחיל, להוסיף את מדיום הניתוח של שניידר או SM לשני שקעים רצופים של צלחת ספוט מבריק ולהוסיף PBS לדיכאון הבא. בעזרת זוג מלקחיים, בחרו זחלים נודדים של כוכב שלישי והניחו אותם על רקמה עם PBS כדי לנקות שאריות מזון זבובים.
מניחים את הזחל בדיכאון עם PBS ואחריו דיכאון עוקב המכיל SM. לאחר מכן תחת מיקרוסקופ ניתוח, להשתמש במלקחיים עדינים כדי להסיר שלושה רבעים של הגוף התחתון של הזחל. לאחר מכן לתפוס בעדינות את קרסי הפה זחל עם זוג אחד של מלקחיים ולהחזיק את הקיטור של הקצה השני עם זוג המלקחיים האחרים. להפוך את ראש הזחל מבפנים החוצה על ידי דחיפת קרסי הפה פנימה ובו זמנית קילוף את הרקמה בקצה השני.
התבונן במוח הזחל עם דיסקים דמיוניים מחוברים. הסר רקמות אחרות המחוברות למוח ולהעביר את המוח לדיכאון העוקב לאחר מכן עם SM. הוסף 100 מיקרוליטרים של פתרון EDU SM מיקרומולרי לדיכאון נוסף על צלחת Pyrex ודגר כ 5 עד 10 מוחות ניתחו בתמיסה זו במשך 2 שעות ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר קיבעון וחיסון להסיר PBST ולהוסיף את קוקטייל זיהוי EDU למוחות ניתחו.
ואז לדגור אותם בטמפרטורת החדר בחושך על סירוס. לאחר 30 דקות, לשטוף את הדגימות פעמיים עם PBST במשך 10 דקות לכל לשטוף בחושך. להכתמת DNA, הכינו 5 מיקרוגרם למיליליטר Hoechst 33342 פתרון.
הסר PBST לאחר הכביסה השנייה ולהוסיף 500 microliters של פתרון Hoechst למוחות ניתחו, ולאחר מכן לדגור אותם בחושך. לאחר 10 דקות, להסיר את Hoechst לשטוף את הדגימות עם PBST במשך 10 דקות. הקש על הצינור על ספסל המעבדה ולתת למוח להתיישב.
הסר PBST מהצינור, משאיר מאחור 50 עד 100 microliters. חותכים את הקצה של קצה מיקרופיפט 200 מיקרוליטר ולהשתמש בו כדי להעביר את המוח על שקופית זכוכית נקייה. הסר PBST גישה מהשקופית על-ידי החלקתה עם רצועות נייר סינון.
אל תתנו לנייר הסינון לגעת במוח. שים טיפה של מדיום מסיס במים, לא פלואורסצנטי על המוח וכוון את המוח כך כבל העצבים הגחוני פונה למגלשה והאונות פונות כלפי מעלה. סדרו את המוח בקובץ אחד כך שיהיה קל יותר לדמיין את המוח באופן סדרתי.
מניחים בעדינות פתק כיסוי על גבי המוח ודגר את השקופית למשך הלילה ב-2 עד 6 מעלות צלזיוס. מתוך תוכנת הרכישה בחר את המטרה 63 פעמים. שים טיפה של שמן טבילה על להחליק הכיסוי ממש מעל המוח רכוב כדי להקל על איתור הרקמה דרך העין.
באמצעות ערוץ Hoechst 33342 נדוש, מצא את המוח דרך העין ולאחר מכן עבור למצב הרכישה בתוכנה. הגדר 4 ערוצים כדי לדמיין Hoechst 33342, אלקסה קומה 4 8 8, אלקסה קומה 5 6, 8, ואלכסה קומה 6 4 7. השתמש בכלי מסייע הצבע כדי להגדיר באופן אוטומטי את לייזרי העירור והפליטה שנבחרו.
הגדר את שדה הראייה, כך שהוא מקיף את כל אונת המוח. צלם את כל הנפח של אונת המוח על ידי רכישת מס זה במרווחים 0.8 מיקרון זה מזה. אחסן את כל התמונות מהפעלת הדמיה בתבנית ספריה של Dot L I F.
לניתוח תמונה, פתחו את פיג'י ולאחר מכן גררו ושחררו את קבצי ה-LIF בפיג'י. בחר דפדפן נתונים מהכרטיסיה תצוגת מחסנית והשתמש בערימה וירטואלית מהכרטיסיה ניהול זיכרון בתוסף תבניות ביולוגיות. שים לב לתמונה מרובת הערוצים המוצגת בתמונה J.Change צבע הערוצים מתוך שורת התפריטים, באמצעות הכלי תמונה, צבע וערוצים.
ולנטר את מירנדה שכותרתו neuroblasts, המופיעים כתאים עגולים גדולים באזור המוח המרכזי. צייר אזור של עניין באמצעות הכלי אליפסה על כל neuroblast כדי למנוע לספור את neuroblast פעמיים. מתוך שורת התפריטים של התמונה J, בחר ניתוח, כלים ומנהל על ביצוע על ביצועים.
סמן את כל הנוירובלסטים במקטע Z הנוכחי והקש T לאחר סימון כל תא. לאחר כל neuroblasts בסעיף Z הנוכחי מסומנים, לשנות את הערוצים pH3 ו EDU ולספור באופן ידני את מספר נוירובלסטים חיוביים EDU, נוירובלסטים חיוביים pH3, נוירובלסטים חיוביים EDU ו- pH3, נוירובלסטים לא מכתים עבור אף אחד מהסמן. חפש נוירובלסטים ומקטעי Z הבאים, מחק ROIs ישנים והוסף ROIs חדשים לספירת neuroblasts בערימות שונות.
הכן גיליון אלקטרוני וחשב אחוזים של נוירובלסטים הקיימים בכל ארבע הקטגוריות עבור כל אונה. הכן גרף עמודות באמצעות תוכנת הגיליונות האלקטרוניים, המציג את נתוני מאגרים עבור אחוזים של neuroblasts בכל קטגוריה. נוירובלסטים מרכזיים במוח ממוחות זחלי הכוכב השלישי המסומנים במירנדה, EDU ו- pH3 מוצגים כאן.
תאים הוקצו לשלבי G1/G0, S, SG2/M ו- M. בניתוח pH3 EDU, שיעור גבוה משמעותית של MMS19, אובדן נוירובלסטים פונקציה נמצא בשלב M לעומת neuroblasts סוג פראי. ביטוי MMS19:eGFP באובדן הרקע של הפונקציה MMS19 הציל את שיעור התאים בשלב M לרמות סוג פראי.
חשוב לא להשתמש במוחות פגומים לצעדים הבאים. ופתרון אד צריך להיות מוכן טרי לפני תחילת ניתוחים. נכס זה יכול לשמש כמיון ראשוני מהיר כדי לזהות פגמים בשלבי מחזור תאים ספציפיים.
לאחר מכן ניתן לעקוב אחר ניתוח מפורט יותר של שלב מסוים.
