マイクロパターニング靭皮細胞キラリティーアッセイは、疾患の発症における多細胞キラル形態形成を研究するための強力なツールである。また、細胞研究にも重要です。このマクロパターンシステムは、製造と使用が簡単で、信頼性が高く再現性の高い結果を生み出すことができ、大きなサンプルサイズの自動ハイスループット処理とも互換性があります。
チタンゴールドコーティングされたスライドを約12×12ミリメートルの小さな正方形のピースに切断することから始めます。ガラスカッターを使用して、表面を横切ってスライドさせてへこんだトラックを残してから、スライドガラスを両側に持ち、凹みで曲げて小さな四分の一に割れます。スライドをきれいにするには、オービタルシェーカーのペトリ皿に入った100%エタノールに金の側面を上にして少なくとも10分間浸します。
エタノールを吸引した後、窒素気流で吹き付けてスライドを乾燥させる。ポリジメチルシロキサンまたはPDMSスタンプを石鹸水で拭いてから、窒素ガスでスタンプを乾燥させます。5.74ミリグラムのオクタデカンチオールまたはC18を10ミリリットルの100%エタノールに溶解して2ミリモルのC18溶液を作り、PDMSスタンプを100%エタノールで洗浄する。
パターン面を下に向けたPDMSスタンプをC18溶液に10秒間浸した後、窒素ガスで60秒間穏やかに乾燥させます。乾かしたら、スタンプを金のスライドの上に下を向いて60秒間置いてから取り出します。適切なスタンプを確実に押すには、ピンセットをスタンプに軽く叩いて、パターンを適切に転写します。
次に、70%エタノール1ミリリットルを逆ペトリ皿の蓋にピペッティングして湿度チャンバーを準備する。ピンセットを使用して、パラフィルムを1枚敷いて表面を覆い、気泡が残らないようにします。必要に応じて余分なエタノールを除去します。
各4分の1のガラススライドに40マイクロリットルのEG3溶液の液滴を湿度チャンバ内のパラフィルムに加え、液滴間に金スライドの間隔を説明するのに十分なスペースを残します。ピンセットを使用して、C18 プリントされたゴールドのスライドを液滴の上に下に向けて置き、スライドの下に泡が残らないようにします。スライドを持ち上がらずにスライドを静かに押して、蒸発を最小限に抑えます。
ペトリ皿をパラフィルムでしっかりと密封した後、室温で少なくとも3時間放置する。バイオセーフティキャビネット内で、上を向いているゴールドスライドを70%エタノールに3回浸してすすぎ、EG3を除去し、滅菌のためにエタノール中に10分間放置します。エタノールを吸引した後、滅菌PBSを加える。
実証したようにエタノールの代わりにPBSで別の湿度チャンバーを準備します。次に、4分の1ごとに50マイクロリットルのフィブロネクチン溶液の液滴をパラフィルム上にスライドさせ、液滴間にいくらかのスペースを残します。次に、前述のようにスライドを液滴の上に下向きに置き、ペトリ皿をバイオセーフティキャビネットに30分間放置します。
金色のコーティングされたスライドを3回すすぎ洗いした後、スライドをPBSで上向きに置きます。細胞を播種する前に、培地とトリプシンを摂氏37度で焼戻しした水浴中で温めます。細胞付着を改善するには、パターンスライドを培養培地を含む12ウェルプレートに浸し、インキュベーター内で摂氏37度で温めます。
細胞がトリプシン処理されたら、FBS含有培地で細胞を中和し、3分間、100倍Gで細胞をペレットダウンし、次いで細胞ペレットを新鮮な培地に再懸濁する。細胞を数え、細胞懸濁液を希釈して、1ミリリットルあたり200,000細胞の濃度を達成する。1つの金スライドを含む各ウェルに0.5ミリリットルの細胞懸濁液を加える。
均一な細胞播種のためにプレートを数回静かに振とうしてから、細胞付着のために15分間インキュベートする。15分後、顕微鏡下で細胞付着を確認し、必要に応じて、さらにしばらくインキュベートする。細胞が付着したら、各ウェルから未接着の細胞を含む培地を吸引し、1ミリリットルの新鮮な培養培地を加える。
細胞をインキュベーター内で24時間培養し、コンフルエント性をチェックしてキラリティーが形成されたかどうかを判断する。必要なコンフルエント性が達成されたら、培養培地を除去して細胞を固定する。PBSで1回リンスした後、スライドに4%パラホルムアルデヒド溶液を加え、室温で15分間インキュベートした後、PBSで再度3回リンスする。
画像を取得するには、カメラ機能を備えた位相差顕微鏡を使用し、スライド上の各リングを高解像度でキャプチャします。キラリティ特性評価を行うには、MATLAB コード ファイルをダウンロードし、コード フォルダーとサブフォルダーを MATLAB パスに追加して、ROI_selectionを開きます。m ファイル。
4 行目で、ディレクトリを目的のデータ フォルダーに変更します。14 行目の画像サイズを変更して、最初の 2 つの図形がリングの内側の円のサイズを表し、他の 2 つの図形が外側の円のサイズを表します。位相差画像の関心領域またはROIを決定するには、MATLABコードROI_selectionを実行します。
m を実行して実行ボタンをクリックします。リングに合うように選択範囲の正方形を手動でドラッグし、画像をダブルクリックして選択を確定します。フォルダ内のすべての画像からROIを選択すると、各画像のROI情報を格納するmatファイルが生成されます。
次に、analysis_batchを開きます。mファイルを作成し、前述のようにフォルダのディレクトリを変更します。実行ボタンをクリックして、analysis_batchにコードを実行します。
mは、複数の細胞リングパターンのキラリティーを決定する。データトエクセル。txtファイルは、各リングの循環統計と、時計回りの非キラルリングと反時計回りのリングの数を含む生成されます。
今回の知見は、開発されたリングパターンキラリティアッセイの有用性を実験的に実証するとともに、細胞骨格の変化に対するこのアッセイの感度を実証している。本研究では、50ナノモルのラトルンクリンA処理でアクチン重合を破壊することにより、マウス筋芽細胞C2C12細胞は反時計回りまたはCCWキラルバイアスの変化を示し、時計回りまたは CW.In 加えて、プロテインキナーゼCを活性化するために12-o-テトラデカノイル-ホルボール-13-アセテートまたはTPAで処理したヒト臍帯血管内皮細胞またはhUVECは、CWからCCWへの細胞キラリティーの用量依存的なシフトを示した。パターンに細胞を播種した後、化学物質または薬物を培地に補充して応答を研究することができ、トランスウェル系を組み込んで細胞共培養を研究することができる。
このアッセイは、異なる実験環境下で多細胞キラリティーを調査するための効率的なツールを提供し、様々な生物学的現象およびプロセスにおける細胞キラリティーの役割に関する重要な洞察を提供する。
