Микроструктурирование анализа хиральности клеток лубяных клеток является мощным инструментом для изучения многоклеточного хирального морфогенеза в развитии заболевания. Это также важно для исследований клеток. Эта макроструктурная система проста в изготовлении и использовании, способна давать высоконадежные и повторяемые результаты, а также совместима с автоматизированной высокопроизводительной обработкой для большого размера выборки.
Начните с резки титанового золотого слайда на небольшие квадратные кусочки размером примерно 12 на 12 миллиметров. Используя стеклорез, скользите по поверхности, чтобы оставить помятый след, затем держите стеклянную горку с обеих сторон и согните вмятину, чтобы разбиться на небольшие четверти. Чтобы очистить горку, замочите ее золотой стороной вверх в 100% этаноле, содержащемся в чашке Петри на орбитальном шейкере, не менее чем на 10 минут.
После аспирации этанола высушите горку, продувая струей азота. Очистите полидиметилсилоксановые или PDMS штампы мыльной водой перед сушкой штампа газообразным азотом. Растворить 5,74 миллиграмма октадеканетиола или С18 в 10 миллилитрах 100% этанола, чтобы получить два раствора миллимоляров С18, затем очистить штампы PDMS 100% этанолом.
Замочите штамп PDMS поверхностью узора, обращенной вниз в растворе C18 в течение 10 секунд, а затем осторожно высушите его газообразным азотом в течение 60 секунд. После высыхания положите штамп лицом вниз на золотую горку в течение 60 секунд перед снятием. Чтобы обеспечить правильную штамповку, осторожно постучите пинцетом по штампу, чтобы правильно перенести узоры.
Затем подготовьте камеры влажности, пипетировав один миллилитр 70% этанола в перевернутую крышку чашки Петри. И, используя пинцет, положите кусок парапленки, чтобы покрыть поверхность, гарантируя, что не останется пузырьков. При необходимости удалите избыток этанола.
Добавьте 40 микролитровых капель раствора EG3 на каждую четверть стекла, скользящего на парапленку в камере влажности, оставляя достаточно места между каплями, чтобы учесть расстояние между золотыми слайдами. Используйте пинцет, чтобы поместить напечатанный C18 золотой слайд лицом вниз на каплю, гарантируя, что под слайдом не останется пузырьков. Осторожно сожмите горки вместе, не поднимая их, чтобы свести к минимуму испарение.
Плотно запечатав чашку Петри парапленкой, оставьте ее при комнатной температуре не менее трех часов. В шкафу для биобезопасности замочите и промойте золотую горку, обращенную вверх три раза вверх в 70% этаноле, чтобы удалить EG3, затем оставьте в этаноле на 10 минут для стерилизации. После аспирации этанола добавляют стерильный PBS.
Подготовьте еще одну камеру влажности с PBS вместо этанола, как показано на рисунке. Затем добавьте 50 микролитровых капель раствора фибронектина на каждую четверть, скользите по парапленке, оставляя некоторое пространство между каплями. Затем поместите горку вниз на каплю, как показано ранее, и оставьте чашку Петри в шкафу биобезопасности на 30 минут.
Трижды промыв горку с золотым покрытием, поместите горку вверх в PBS. Перед посевом клеток согрейте среду и трипсин на водяной бане, закаленной при 37 градусах Цельсия. Для лучшего прикрепления клеток замочите слайд узора в 12-луночной пластине, содержащей питательные среды, и согрейте его при 37 градусах Цельсия в инкубаторе.
Как только клетки будут трипсинизированы, нейтрализуйте клетки с помощью FBS, содержащей среду, гранулируйте клетки в 100 раз G в течение трех минут, а затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежей среде. Подсчитайте клетки и разбавьте клеточную суспензию до достижения концентрации 200 000 клеток на миллилитр. Добавьте 0,5 миллилитра клеточной суспензии к каждой лунке, содержащей один золотой слайд.
Осторожно встряхните пластину несколько раз для равномерного посева клеток перед инкубацией в течение 15 минут для прикрепления клеток. Через 15 минут проверьте прикрепление клеток под микроскопом и, при необходимости, инкубируйте еще некоторое время. Как только клетки прикреплены, аспирируйте среду, содержащую неприкрепленные клетки, из каждой лунки и добавьте один миллилитр свежей культуральной среды.
Культивируйте клетки в инкубаторе в течение 24 часов и проверяйте слияние, чтобы определить, сформировалась ли хиральность. Когда необходимая сливаемость достигнута, зафиксируйте клетки, удалив питательные среды. После однократного ополаскивания PBS добавьте 4%-ный раствор параформальдегида к слайду и высиживайте комнатную температуру в течение 15 минут, прежде чем снова промыть PBS три раза.
Чтобы получить изображения, используйте фазово-контрастный микроскоп с функциональностью камеры и захватите каждое кольцо на слайде с высоким разрешением. Для определения характеристик хиральности загрузите файлы кода MATLAB, добавьте папку кода и вложенные папки в путь MATLAB и откройте ROI_selection. m файл.
В четвертой строке измените каталог на нужную папку данных. Измените размер изображения в строке 14, чтобы первые две фигуры представляли размер внутреннего круга кольца, а два других представляли внешний. Чтобы определить интересующую область или рентабельность инвестиций в изображениях фазового контраста, выполните код MATLAB ROI_selection.
m, нажав кнопку выполнить. Вручную перетащите квадрат выделения, чтобы он соответствовал кольцу, затем дважды щелкните изображение, чтобы подтвердить выделение. После выбора ROI из всех изображений в папке будет сгенерирован матовый файл для хранения информации о рентабельности инвестиций для каждого изображения.
Затем откройте analysis_batch. m и измените каталог папки, как показано выше. Нажмите кнопку «Выполнить», чтобы выполнить код analysis_batch.
m для определения хиральности множественных клеточных кольцевых паттернов. A datatoexcel. будет сгенерирован txt файл, содержащий круговую статистику для каждого кольца, а также числа колец по часовой стрелке, не относящихся к хиральной и против часовой стрелки.
Текущие результаты демонстрируют полезность экспериментального анализа хиральности разработанного кольцевого паттерна, а также чувствительность этого анализа к изменениям в цитоскелете. В настоящем исследовании было обнаружено, что, нарушая полимеризацию актина с помощью 50 наномолярного латрункулина А, клетки миобласта C2C12 мыши проявляли изменение против часовой стрелки или хирального смещения CCW по часовой стрелке или CW.In добавления, клетки эндотелия пуповинных сосудов человека или hUVEC, которые обрабатывали 12-о-тетрадеканоил-форбол-13-ацетатом или TPA для активации протеинкиназы C, демонстрировали дозозависимый сдвиг хиральности клеток от CW к CCW. После посева клеток в паттерны, химические вещества или лекарства могут быть добавлены в среду для изучения ответа, а трансвелл-система может быть включена для изучения клеточной кокультуры.
Этот анализ обеспечивает эффективный инструмент для исследования многоклеточной хиральности в различных экспериментальных условиях, что дает важное представление о роли хиральности клеток в различных биологических явлениях и процессах.
