O ensaio de quiralidade celular bast micropatterning é uma ferramenta poderosa para estudar morfogense quiral multicelular no desenvolvimento da doença. Também é importante para a pesquisa celular. Este sistema de macropattern é fácil de fabricar e usar, é capaz de produzir resultados altamente confiáveis e repetíveis, e também é compatível com processamento automatizado de alto rendimento para grande tamanho amostral.
Comece cortando o slide revestido de ouro de titânio em pequenos pedaços quadrados de aproximadamente 12 por 12 milímetros. Usando um cortador de vidro, deslize pela superfície para deixar uma faixa amassada, em seguida, segure o deslizamento de vidro em ambos os lados e dobre no amassado para quebrar em pequenos quartos. Para limpar o slide, mergulhe-o com o lado dourado para cima em 100% etanol contido em uma placa de Petri em um shaker orbital por pelo menos 10 minutos.
Depois de aspirar o etanol, seque o deslizamento soprando com um fluxo de nitrogênio. Limpe os selos de polidimotilatilatilato ou PDMS com água com sabão antes de secar o carimbo com gás nitrogênio. Dissolva 5,74 miligramas de octadecanethiol ou C18 em 10 mililitros de 100% de etanol para fazer duas soluçãos milimolares C18, depois limpe os selos PDMS com 100% de etanol.
Mergulhe o carimbo PDMS com a superfície padrão virada para baixo na solução C18 por 10 segundos e, em seguida, seque-o suavemente com gás nitrogênio por 60 segundos. Uma vez seco, coloque o carimbo virado para baixo no slide de ouro por 60 segundos antes da remoção. Para garantir a correta estampagem, bata suavemente na pinça no selo para transferir corretamente os padrões.
Em seguida, prepare as câmaras de umidade, canalizar um mililitro de 70% de etanol em uma tampa de placa de Petri invertida. E usando a pinça, deite um pedaço de parafilme para cobrir a superfície garantindo que não haja bolhas. Remova o excesso de etanol, se necessário.
Adicione 40 gotículas de microliter da solução EG3 para cada quarto de deslizamento de vidro no parafilme na câmara de umidade, deixando espaço suficiente entre as gotículas para explicar o espaçamento dos slides de ouro. Use pinças para colocar o slide de ouro impresso C18 voltado para baixo na gotícula, garantindo que não permaneçam bolhas sob o slide. Empurre suavemente os slides juntos sem levantá-los para minimizar a evaporação.
Depois de selar a placa de Petri firmemente com parafilm, deixe-a em temperatura ambiente por pelo menos três horas. Em um armário de biossegurança, mergulhe e enxágue o slide de ouro voltado três vezes em 70% de etanol para remover o EG3, depois deixe no etanol por 10 minutos para esterilização. Depois de aspirar o etanol, adicione PBS estéril.
Prepare outra câmara de umidade com PBS em vez de etanol como demonstrado. Em seguida, adicione 50 gotículas de microliter de solução de fibronectina para cada quarto deslizar para o parafilme, deixando algum espaço entre gotículas. Em seguida, coloque o slide voltado para baixo na gota como demonstrado anteriormente e deixe a placa de Petri no armário de biossegurança por 30 minutos.
Depois de enxaguar o slide revestido de ouro três vezes, coloque o slide voltado para cima no PBS. Antes de semear as células, aqueça a mídia e experimente em um banho de água temperado a 37 graus Celsius. Para melhor fixação celular, mergulhe o slide padrão em uma placa de 12 poços contendo mídia cultural e aqueça-o a 37 graus Celsius na incubadora.
Uma vez que as células são experimentadas, neutralize as células com FBS contendo mídia, pelota para baixo as células a 100 vezes G por três minutos e, em seguida, resuspenque a pelota de célula em mídia fresca. Conte as células e dilua a suspensão celular para alcançar a concentração de 200.000 células por mililitro. Adicione 0,5 mililitros da suspensão celular a cada poço contendo um slide de ouro.
Agite suavemente a placa algumas vezes para semeadura uniforme da célula antes de incubar por 15 minutos para fixação celular. Após 15 minutos, verifique o acessório da célula sob um microscópio e, se necessário, incubar por mais algum tempo. Uma vez que as células estejam anexadas, aspire a mídia contendo células não ligadas de cada poço e adicione um mililitro de novas mídias culturais.
Cultume as células na incubadora por 24 horas e verifique a confluência para determinar se a quiralidade se formou. Quando a confluência necessária for alcançada, fixe as células removendo a mídia cultural. Depois de enxaguar com PBS uma vez, adicione 4% de solução de paraformaldeído ao slide e incuba a temperatura ambiente por 15 minutos antes de enxaguar novamente com PBS três vezes.
Para adquirir as imagens, use um microscópio de contraste de fase com a funcionalidade da câmera e capture cada anel no slide em alta resolução. Para caracterização de quiralidade, baixe os arquivos de código MATLAB, adicione a pasta de código e subpastas ao caminho MATLAB e abra o ROI_selection. arquivo m.
Na linha quatro, altere o diretório para a pasta de dados desejada. Altere o tamanho da imagem na linha 14 com as duas primeiras figuras representando o tamanho do círculo interno do anel, enquanto as outras duas representam o exterior. Para determinar a região de interesse ou ROI nas imagens de contraste de fase, execute o código MATLAB ROI_selection.
m clicando no botão executar. Arraste manualmente o quadrado de seleção para encaixar o anel e clique duas vezes na imagem para confirmar a seleção. Depois de selecionar o ROI de todas as imagens da pasta, um arquivo de tapete será gerado para armazenar as informações do ROI para cada imagem.
Então abra o analysis_batch. m arquivar e alterar o diretório da pasta como demonstrado anteriormente. Clique no botão executar para executar o código analysis_batch.
m para determinar a quiralidade de múltiplos padrões de anéis celulares. Um datatoexcel. o arquivo txt será gerado contendo estatísticas circulares para cada anel, bem como os números de anéis não quiral e anti-horário no sentido horário.
Os achados atuais demonstram a utilidade do ensaio de quiralidade do padrão do anel desenvolvido experimentalmente, bem como a sensibilidade deste ensaio a alterações no citoesqueleto. No presente estudo, verificou-se que, ao interromper a polimerização de actina com tratamento de latrunculina de 50 nanomolar A, as células myoblast C2C12 do camundongo apresentaram uma alteração do viés quiral no sentido anti-horário ou CCW no sentido horário ou CW.In adição, as células endoteliais vasculares umbilicais humanas ou hUVECs que foram tratadas com 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetato ou TPA para ativar a proteína quinase C exibiu uma mudança dependente de dose da quiralidade celular de CW para CCW. Após a semeadura celular aos padrões, produtos químicos ou medicamentos podem ser complementados ao meio para estudar a resposta, e o sistema transwell pode ser incorporado para estudar a co-cultura celular.
Este ensaio fornece uma ferramenta eficiente para investigar a quiralidade multicelular em diferentes configurações experimentais que oferece insights importantes sobre o papel da quiralidade celular em vários fenômenos e processos biológicos.
