마이크로 패터닝 bast 세포 키랄 성 분석은 질병 발달에서 다세포 키랄 형태 형성을 연구하기위한 강력한 도구입니다. 그것은 또한 세포 연구에 중요합니다. 이 매크로 패턴 시스템은 제작 및 사용이 쉽고 신뢰성이 높고 반복 가능한 결과를 생성 할 수 있으며 큰 샘플 크기에 대한 자동화 된 고처리량 처리와도 호환됩니다.
티타늄 금으로 코팅 된 슬라이드를 약 12 x 12 밀리미터의 작은 사각형 조각으로 절단하여 시작하십시오. 유리 커터를 사용하여 표면을 가로 질러 미끄러 져 움푹 들어간 트랙을 남긴 다음 유리 슬라이드를 양쪽으로 잡고 움푹 들어간 곳에서 구부려 작은 분기로 나눕니다. 슬라이드를 청소하려면 페트리 접시에 들어있는 100 % 에탄올에 금면을 올려 오비탈 쉐이커의 10 분 이상 담그십시오.
에탄올을 흡인한 후, 질소 기류로 송풍하여 슬라이드를 건조시킨다. 폴리디메틸실록산 또는 PDMS 스탬프를 질소 가스로 건조시키기 전에 비눗물로 청소하십시오. 5.74 밀리그램의 옥타데칸티올 또는 C18을 100 % 에탄올 10 밀리리터에 녹여 2 밀리몰 C18 용액을 만든 다음 PDMS 스탬프를 100 % 에탄올로 청소하십시오.
패턴 표면이 아래로 향하도록 PDMS 스탬프를 C18 용액에 10초 동안 담근 다음 질소 가스로 60초 동안 부드럽게 건조시킵니다. 일단 건조되면, 제거하기 전에 60 초 동안 금 슬라이드에 우표를 아래로 향하게하십시오. 적절한 스탬핑을 보장하려면 핀셋을 스탬프에 부드럽게 탭하여 패턴을 적절하게 전달하십시오.
다음으로, 70 % 에탄올 한 밀리리터를 거꾸로 된 페트리 접시 뚜껑에 피펫팅하여 습도 챔버를 준비하십시오. 핀셋을 사용하여 표면을 덮을 파라필름 조각을 내려 놓고 거품이 남지 않도록하십시오. 필요한 경우 과도한 에탄올을 제거하십시오.
각 분기 유리 슬라이드마다 EG3 용액의 40 마이크로 리터 물방울을 습도 챔버의 파라 필름에 추가하여 물방울 사이에 금 슬라이드의 간격을 고려하여 충분한 공간을 남겨 둡니다. 핀셋을 사용하여 C18 프린트된 골드 슬라이드를 물방울 위에 아래로 향하게 배치하여 슬라이드 아래에 거품이 남지 않도록 합니다. 슬라이드를 들어 올리지 않고 부드럽게 밀어 증발을 최소화하십시오.
페트리 접시를 파라 필름으로 단단히 밀봉 한 후 적어도 세 시간 동안 실온에서 그대로 두십시오. 생물안전 캐비닛에서 금 슬라이드를 70% 에탄올에 3번 담그고 헹구어 EG3를 제거한 다음 에탄올에 10분간 방치하여 살균합니다. 에탄올을 흡인 후, 멸균 PBS를 첨가한다.
시연된 바와 같이 에탄올 대신 PBS로 또 다른 습도 챔버를 준비한다. 다음으로, 각 분기 슬라이드마다 50 마이크로 리터의 피브로넥틴 용액 방울을 파라 필름 상에 첨가하여 물방울 사이에 약간의 공간을 남겨 둡니다. 그런 다음 이전에 설명 된대로 슬라이드를 물방울 위에 아래로 향하게하고 Petri 접시를 생물 안전 캐비닛에 30 분 동안 두십시오.
금이 코팅된 슬라이드를 세 번 헹구고 난 후, 슬라이드를 위로 향하게 하여 PBS에 놓는다. 세포를 파종하기 전에 섭씨 37도에서 단련 된 수조에서 배지와 트립신을 따뜻하게하십시오. 더 나은 세포 부착을 위해, 패턴 슬라이드를 배양 배지가 들어있는 12-웰 플레이트에 담그고 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 가온하십시오.
일단 세포가 트립신화되면, 세포를 FBS 함유 배지로 중화시키고, 세포를 100배 G에서 3분 동안 펠릿 다운한 다음, 세포 펠릿을 신선한 배지에 재현탁시킨다. 세포를 계수하고 세포 현탁액을 희석하여 밀리리터 당 200, 000 세포의 농도를 달성하십시오. 0.5 밀리리터의 셀 현탁액을 하나의 골드 슬라이드가 들어있는 각 웰에 첨가하십시오.
세포 부착을 위해 15분 동안 인큐베이션하기 전에 균일한 세포 시딩을 위해 플레이트를 몇 번 부드럽게 진탕한다. 15분 후, 현미경으로 세포 부착을 확인하고, 필요하다면, 좀 더 많은 시간 동안 배양한다. 일단 세포가 부착되면, 부착되지 않은 세포를 포함하는 배지를 각 웰에서 흡인하고 한 밀리리터의 신선한 배양 배지를 첨가한다.
세포를 24시간 동안 배양기에서 배양하고 컨플루언시를 확인하여 키랄성이 형성되었는지 여부를 결정한다. 필요한 컨플루언시가 달성되면, 배양 배지를 제거하여 세포를 고정시킨다. PBS로 한번 헹구고 난 후, 슬라이드에 4%파라포름알데히드 용액을 첨가하고, PBS로 다시 세 번 헹구기 전에 15분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
이미지를 획득하려면 카메라 기능이 있는 위상차 현미경을 사용하고 슬라이드의 각 링을 고해상도로 캡처합니다. 키랄성 특성화를 위해 MATLAB 코드 파일을 다운로드하고 코드 폴더와 하위 폴더를 MATLAB 경로에 추가한 다음 ROI_selection을 엽니다. m 파일.
네 번째 줄에서 디렉터리를 원하는 데이터 폴더로 변경합니다. 라인 14의 이미지 크기를 처음 두 그림은 링의 내부 원 크기를 나타내고 다른 두 개는 바깥쪽을 나타내는 것으로 변경합니다. 위상차 이미지에서 관심 영역 또는 ROI를 확인하려면 MATLAB 코드 ROI_selection을 실행합니다.
m 실행 버튼을 클릭하여. 수동으로 선택 사각형을 드래그하여 링에 맞게 한 다음 이미지를 두 번 클릭하여 선택을 확인합니다. 폴더의 모든 이미지에서 ROI를 선택하면 각 이미지에 대한 ROI 정보를 저장하기 위해 매트 파일이 생성됩니다.
그런 다음 analysis_batch를 엽니 다. m 파일을 만들고 이전에 설명 된대로 폴더의 디렉토리를 변경하십시오. 실행 버튼을 클릭하여 코드를 analysis_batch 실행합니다.
m은 다중 세포 고리 패턴의 키랄성을 결정한다. 데이터토엑셀. txt 파일은 각 링에 대한 원형 통계뿐만 아니라 시계 방향이 아닌 키랄 및 반 시계 방향 링의 수를 포함하여 생성됩니다.
현재의 발견은 실험적으로 개발 된 고리 패턴 키랄성 분석의 유용성뿐만 아니라 세포 골격의 변화에 대한이 분석의 민감도를 입증합니다. 본 연구에서, 50 나노몰 라트룬쿨린 A 처리로 액틴 중합을 파쇄함으로써, 마우스 근원세포 C2C12 세포가 시계 반대 방향 또는 CCW 키랄 바이어스의 변화를 시계 방향 또는 CW.In 으로 변화시켰음을 발견하였고, 또한 인간 탯줄 혈관 내피 세포 또는 단백질 키나아제 C를 활성화시키기 위해 12-o-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate 또는 TPA로 처리한 hUVECs는 CW에서 CCW로의 세포 키랄성의 용량 의존적 이동을 나타내었다. 패턴에 세포를 시딩한 후, 화학물질 또는 약물은 반응을 연구하기 위해 배지에 보충될 수 있고, 트랜스웰 시스템은 세포 공동 배양을 연구하기 위해 혼입될 수 있다.
이 분석은 다양한 실험 환경에서 다세포 키랄성을 조사하기위한 효율적인 도구를 제공하여 다양한 생물학적 현상 및 과정에서 세포 키랄성의 역할에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.
