Il test di chiralità delle cellule bast di micropatterning è un potente strumento per studiare la morfogenesi chirale multicellulare nello sviluppo della malattia. È anche importante per la ricerca cellulare. Questo sistema macropattern è facile da fabbricare e utilizzare, è in grado di produrre risultati altamente affidabili e ripetibili ed è anche compatibile con l'elaborazione automatizzata ad alta produttività per campioni di grandi dimensioni.
Inizia tagliando il vetrino rivestito in titanio dorato in piccoli pezzi quadrati di circa 12 per 12 millimetri. Usando una fresa per vetro, fai scorrere la superficie per lasciare una traccia ammaccata, quindi tieni la diapositiva di vetro su entrambi i lati e piegati sull'ammaccatura per romperla in piccoli quarti. Per pulire la diapositiva, immergerla con il lato dorato in etanolo al 100% contenuto in una capsula di Petri su uno shaker orbitale per almeno 10 minuti.
Dopo aver aspirato l'etanolo, asciugare il vetrino soffiando con un flusso di azoto. Pulire i timbri polidimetilsilossano o PDMS con acqua saponata prima di asciugare il timbro con azoto gassoso. Sciogliere 5,74 milligrammi di ottadecanetiolo o C18 in 10 millilitri di etanolo al 100% per ottenere due soluzione millimolare C18, quindi pulire i timbri PDMS con etanolo al 100%.
Immergere il timbro PDMS con la superficie del modello rivolta verso il basso nella soluzione C18 per 10 secondi e quindi asciugarlo delicatamente con azoto gassoso per 60 secondi. Una volta asciugato, posare il timbro rivolto verso il basso sul vetrino d'oro per 60 secondi prima della rimozione. Per garantire una corretta stampa, picchiettare delicatamente le pinzette sul timbro per trasferire correttamente i motivi.
Quindi, preparare le camere di umidità pipettando un millilitro di etanolo al 70% in un coperchio invertito della capsula di Petri. E usando le pinzette, stendere un pezzo di parafilm per coprire la superficie assicurandosi che non rimangano bolle. Rimuovere l'etanolo in eccesso, se necessario.
Aggiungere 40 goccioline di microlitro di soluzione EG3 per ogni quarto di vetrino sul parafilm nella camera di umidità, lasciando spazio sufficiente tra le goccioline per tenere conto della spaziatura delle diapositive dorate. Usa una pinzetta per posizionare la diapositiva d'oro stampata C18 rivolta verso il basso sulla goccia, assicurandoti che non rimangano bolle sotto la diapositiva. Spingere delicatamente le diapositive insieme senza sollevarle per ridurre al minimo l'evaporazione.
Dopo aver sigillato saldamente la capsula di Petri con parafilm, lasciarla a temperatura ambiente per almeno tre ore. In un armadietto di biosicurezza, immergere e risciacquare il vetrino d'oro rivolto verso l'alto tre volte in etanolo al 70% per rimuovere EG3, quindi lasciare in etanolo per 10 minuti per la sterilizzazione. Dopo aver aspirato l'etanolo, aggiungere PBS sterile.
Preparare un'altra camera di umidità con PBS invece di etanolo come dimostrato. Quindi, aggiungere 50 goccioline di microlitro di soluzione di fibronectina per ogni quarto scivolare sul parafilm, lasciando un po 'di spazio tra le goccioline. Quindi posizionare la diapositiva rivolta verso il basso sulla goccia come dimostrato in precedenza e lasciare la capsula di Petri nell'armadio di biosicurezza per 30 minuti.
Dopo aver risciacquato tre volte il vetrino rivestito in oro, posizionare il vetrino rivolto verso l'alto in PBS. Prima di seminare le cellule, riscaldare il mezzo e la tripsina a bagnomaria temperati a 37 gradi Celsius. Per un migliore fissaggio cellulare, immergere la diapositiva del modello in una piastra a 12 pozzetti contenente terreni di coltura e riscaldarla a 37 gradi Celsius nell'incubatore.
Una volta che le cellule sono tripsinizzate, neutralizzare le cellule con mezzi contenenti FBS, pellet giù le cellule a 100 volte G per tre minuti e quindi risospese il pellet cellulare in mezzi freschi. Contare le cellule e diluire la sospensione cellulare per raggiungere la concentrazione di 200.000 cellule per millilitro. Aggiungere 0,5 millilitri di sospensione cellulare a ciascun pozzetto contenente un vetrino d'oro.
Agitare delicatamente la piastra un paio di volte per la semina cellulare uniforme prima di incubare per 15 minuti per l'attaccamento cellulare. Dopo 15 minuti, controllare l'attacco cellulare al microscopio e, se necessario, incubare per un altro po 'di tempo. Una volta che le cellule sono attaccate, aspirare il mezzo contenente cellule non attaccate da ciascun pozzetto e aggiungere un millilitro di terreno di coltura fresco.
Coltiva le cellule nell'incubatore per 24 ore e controlla la confluenza per determinare se si è formata la chiralità. Quando viene raggiunta la confluenza richiesta, fissare le celle rimuovendo il terreno di coltura. Dopo aver risciacquato con PBS una volta, aggiungere la soluzione di paraformaldeide al 4% al vetrino e incubare la temperatura ambiente per 15 minuti prima di risciacquare nuovamente con PBS tre volte.
Per acquisire le immagini, utilizzare un microscopio a contrasto di fase con funzionalità della fotocamera e catturare ogni anello sul vetrino ad alta risoluzione. Per la caratterizzazione della chiralità, scarica i file di codice MATLAB, aggiungi la cartella del codice e le sottocartelle al percorso MATLAB e apri il ROI_selection. m file.
Nella riga quattro, modificare la directory nella cartella di dati desiderata. Modificare le dimensioni dell'immagine nella riga 14 con le prime due figure che rappresentano la dimensione del cerchio interno dell'anello mentre le altre due rappresentano l'esterno. Per determinare la regione di interesse o il ROI nelle immagini a contrasto di fase, esegui il codice MATLAB ROI_selection.
m facendo clic sul pulsante Esegui. Trascina manualmente il quadrato di selezione per adattarlo all'anello, quindi fai doppio clic sull'immagine per confermare la selezione. Dopo aver selezionato il ROI da tutte le immagini nella cartella, verrà generato un file mat per memorizzare le informazioni sul ROI per ogni immagine.
Quindi aprire il analysis_batch. m e modificare la directory della cartella come illustrato in precedenza. Fare clic sul pulsante Esegui per eseguire il codice analysis_batch.
m per determinare la chiralità di più modelli di anelli cellulari. A datatoexcel. Verrà generato un file txt contenente statistiche circolari per ogni anello, nonché i numeri di anelli non chirali e antiorario in senso orario.
I risultati attuali dimostrano l'utilità del test di chiralità del modello ad anello sviluppato sperimentalmente e la sensibilità di questo test alle alterazioni del citoscheletro. Nel presente studio, è stato scoperto che interrompendo la polimerizzazione dell'actina con 50 nanomolari latrunculinA A trattamento, le cellule del mioblasto di topo C2C12 hanno mostrato un'alterazione del bias chirale in senso antiorario o CCW in senso orario o CW.In aggiunta, le cellule endoteliali vascolari ombelicali umane o hUVECs che sono state trattate con 12-o-tetradecanoil-forbol-13-acetato o TPA per attivare la proteina chinasi C hanno mostrato uno spostamento dose-dipendente della chiralità cellulare da CW a CCW. Dopo la semina cellulare ai modelli, sostanze chimiche o farmaci possono essere integrati al mezzo per studiare la risposta e il sistema transwell può essere incorporato per studiare la co-coltura cellulare.
Questo test fornisce uno strumento efficace per studiare la chiralità multicellulare in diversi contesti sperimentali e offre importanti approfondimenti sul ruolo della chiralità cellulare in vari fenomeni e processi biologici.
