Le test de chiralité des cellules libériennes à micromotifs est un outil puissant pour étudier la morphogenèse chirale multicellulaire dans le développement de la maladie. Il est également important pour la recherche cellulaire. Ce système de macromotitre est facile à fabriquer et à utiliser, est capable de produire des résultats hautement fiables et reproductibles, et il est également compatible avec le traitement automatisé à haut débit pour les échantillons de grande taille.
Commencez par couper la glissière recouverte d’or en titane en petits morceaux carrés d’environ 12 par 12 millimètres. À l’aide d’un coupe-verre, glissez sur la surface pour laisser une trace bosselée, puis maintenez la glissière de verre des deux côtés et pliez-la à la bosse pour se briser en petits quartiers. Pour nettoyer la lame, faites-la tremper avec le côté or vers le haut dans de l’éthanol 100% contenu dans une boîte de Petri sur un agitateur orbital pendant au moins 10 minutes.
Après avoir aspiré l’éthanol, sécher la lame en soufflant avec un flux d’azote. Nettoyez les tampons en polydiméthylsiloxane ou PDMS avec de l’eau savonneuse avant de sécher le tampon avec de l’azote gazeux. Dissoudre 5,74 milligrammes d’octadécanéthiol ou de C18 dans 10 millilitres d’éthanol à 100% pour obtenir une solution de C18 de deux millimolaires, puis nettoyer les tampons PDMS avec de l’éthanol à 100%.
Faire tremper le tampon PDMS avec la surface du motif orientée vers le bas dans une solution de C18 pendant 10 secondes, puis sécher doucement avec de l’azote gazeux pendant 60 secondes. Une fois séché, posez le tampon vers le bas sur la glissière en or pendant 60 secondes avant de le retirer. Pour assurer un estampage correct, tapotez doucement la pince à épiler sur le tampon pour transférer correctement les motifs.
Ensuite, préparez les chambres d’humidité en pipetant un millilitre d’éthanol à 70% dans un couvercle de boîte de Petri inversé. Et à l’aide de la pince à épiler, déposez un morceau de parafilm pour couvrir la surface en veillant à ce qu’il ne reste pas de bulles. Retirez l’excès d’éthanol si nécessaire.
Ajouter 40 gouttelettes de microlitre de solution EG3 pour chaque quart de verre coulissant sur le parafilm dans la chambre d’humidité, en laissant suffisamment d’espace entre les gouttelettes pour tenir compte de l’espacement des lames d’or. Utilisez une pince à épiler pour placer la glissière dorée imprimée C18 vers le bas sur la gouttelette, en veillant à ce qu’aucune bulle ne reste sous la glissière. Poussez doucement les glissières ensemble sans les soulever pour minimiser l’évaporation.
Après avoir scellé hermétiquement la boîte de Petri avec du parafilm, laissez-la à température ambiante pendant au moins trois heures. Dans une armoire de biosécurité, tremper et rincer la lame d’or tournée vers le haut trois fois dans de l’éthanol à 70% pour éliminer l’EG3, puis laisser dans l’éthanol pendant 10 minutes pour la stérilisation. Après avoir aspiré l’éthanol, ajoutez du PBS stérile.
Préparez une autre chambre d’humidité avec du PBS au lieu de l’éthanol comme démontré. Ensuite, ajoutez 50 gouttelettes de microlitre de solution de fibronectine pour chaque quart de lame sur le parafilm, en laissant un peu d’espace entre les gouttelettes. Placez ensuite la glissière vers le bas sur la gouttelette comme démontré précédemment et laissez la boîte de Petri dans l’armoire de biosécurité pendant 30 minutes.
Après avoir rincé la glissière recouverte d’or trois fois, placez la glissière vers le haut dans PBS. Avant d’ensemencer les cellules, réchauffez le milieu et la trypsine dans un bain-marie tempéré à 37 degrés Celsius. Pour une meilleure fixation cellulaire, trempez la lame de motif dans une plaque de 12 puits contenant des milieux de culture et réchauffez-la à 37 degrés Celsius dans l’incubateur.
Une fois les cellules trypsinisées, neutralisez les cellules avec des milieux contenant du FBS, abattez les cellules à 100 fois G pendant trois minutes, puis remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu frais. Compter les cellules et diluer la suspension cellulaire pour atteindre la concentration de 200 000 cellules par millilitre. Ajouter 0,5 millilitre de suspension cellulaire à chaque puits contenant une lame dorée.
Secouez doucement la plaque plusieurs fois pour un ensemencement cellulaire uniforme avant d’incuber pendant 15 minutes pour la fixation cellulaire. Après 15 minutes, vérifiez la fixation de la cellule au microscope et, si nécessaire, incubez pendant un certain temps. Une fois les cellules attachées, aspirez les milieux contenant des cellules non attachées de chaque puits et ajoutez un millilitre de milieu de culture frais.
Cultivez les cellules dans l’incubateur pendant 24 heures et vérifiez la confluence pour déterminer si la chiralité s’est formée. Lorsque la confluence requise est atteinte, fixez les cellules en retirant le milieu de culture. Après rinçage avec du PBS une fois, ajouter une solution de paraformaldéhyde à 4% à la lame et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avant de rincer à nouveau avec du PBS trois fois.
Pour acquérir les images, utilisez un microscope à contraste de phase avec fonctionnalité de caméra et capturez chaque anneau sur la diapositive en haute résolution. Pour la caractérisation de la chiralité, téléchargez les fichiers de code MATLAB, ajoutez le dossier de code et les sous-dossiers au chemin MATLAB et ouvrez le ROI_selection. m fichier.
À la ligne quatre, remplacez le répertoire par le dossier de données souhaité. Modifiez la taille de l’image à la ligne 14 avec les deux premières figures représentant la taille du cercle intérieur de l’anneau tandis que les deux autres représentant l’extérieur. Pour déterminer la région d’intérêt ou le retour sur investissement dans les images à contraste de phase, exécutez le code MATLAB ROI_selection.
m en cliquant sur le bouton Exécuter. Faites glisser manuellement le carré de sélection pour l’adapter à l’anneau, puis double-cliquez sur l’image pour confirmer la sélection. Après avoir sélectionné le retour sur investissement parmi toutes les images du dossier, un fichier mat sera généré pour stocker les informations de retour sur investissement de chaque image.
Ouvrez ensuite le analysis_batch. m et modifiez le répertoire du dossier comme illustré précédemment. Cliquez sur le bouton Exécuter pour exécuter le code analysis_batch.
m pour déterminer la chiralité de plusieurs modèles d’anneaux cellulaires. Un datatoexcel. Un fichier txt contenant des statistiques circulaires pour chaque anneau, ainsi que le nombre d’anneaux non chiraux et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre sera généré.
Les résultats actuels démontrent expérimentalement l’utilité du test de chiralité en anneau développé ainsi que la sensibilité de ce test aux altérations du cytosquelette. Dans la présente étude, il a été constaté qu’en perturbant la polymérisation de l’actine avec un traitement à la latrunculine A de 50 nanomolaires, les cellules C2C12 du myoblaste de souris présentaient une altération du biais chiral dans le sens inverse des aiguilles d’une montre ou dans le sens CW.In, les cellules endothéliales vasculaires ombilicales humaines ou les hUVEC qui ont été traitées avec de l’acétate de 12-o-tétradécanoyl-phorbol-13 ou TPA pour activer la protéine kinase C présentaient un déplacement dose-dépendant de la chiralité cellulaire de CW à CCW. Après l’ensemencement cellulaire aux motifs, des produits chimiques ou des médicaments peuvent être complétés dans le milieu pour étudier la réponse, et le système transwell peut être incorporé pour étudier la co-culture cellulaire.
Ce test fournit un outil efficace pour étudier la chiralité multicellulaire dans différents contextes expérimentaux offrant des informations importantes sur le rôle de la chiralité cellulaire dans divers phénomènes et processus biologiques.
