ヒトの眼からのリキッドバイオプシーの分子プロファイリングは、高度に特殊化された眼組織からの何千もの異なる分子を含む局所的に濃縮された液体を捕捉することができます。それらは、生きている人間の眼疾患の分子特性評価を可能にし、新しい診断および治療戦略を特定するさらなる可能性を秘めています。ここでは、眼内手術中の高品質の房水および硝子体リキッドバイオプシーの標準化された収集とバイオバンキングのためのプロトコルを開発しました。
プロトコルの一部は、各サンプルにその寿命にわたって注釈を付けるためのWebベースのデータプライバシー準拠データベースであり、保管中の各バーコード標本の位置を追跡できる座標系の使用により、タンパク質、糖鎖、代謝物分析などの下流実験のための効率的なサンプル検索を可能にします。手術用顕微鏡を使用して、1 mlの注射器に接続された30〜32ゲージの針を使用して、リンバスに垂直な前房副穿刺を行います。この手順中に目を安定させるために綿の先端を使用できます。
眼内構造への損傷を避けるために、針の先端が中央前房の末梢虹彩の上に残っていることを確認してください。顕微鏡による直接可視化下で、1mlの注射器を用いて約100マイクロリットルの原液房水を手動で吸引する。次に、針を前房から慎重に取り外します。
有水晶体の目では、レンズに触れないように針を虹彩の上に置いてください。地球への陽圧は逆流を増加させる可能性があります。針が抜かれる前に綿の先端を離すと、逆流を減らすのに役立ちます。
配管工を引き戻し、空気と収集された液体がどのように動いているかを確認します。シリンジをクライオバイアルに注入します。余分な空気はシリンジのデッドスペースをクリアします。
ここでは、バイアルに永久にエッチングされたバーコードを見ることができます。次に、バーコードを使用して、手術室のコンピューター上のREDCapフォームにサンプルをスキャンします。クライオバイアルは、冷却ボックス内のドライアイス上で直ちに移送されます。
硝子体リキッドバイオプシーは、訓練を受けた硝子体網膜外科医によって硝子体切除術の開始時に得ることができる。硝子体切除カッターは液体で下塗りされないことに注意してください。硝子体腔内で、注入せずに硝子体カッターを作動させて、希釈されていない硝子体サンプルを収集します。
硝子体押出カニューレに接続されている注射器を使用して、0.5〜1mlの硝子体を手動吸引します。次に、正確な上腕骨標本について実証したように、サンプルが処理されます。このビデオは、調査ビューの REDCap で完成したサンプル収集フォームのチュートリアルです。
患者が臨床研究コーディネーターの助けを借りて電子同意を完了すると、このフォームが入力されます。患者が電子同意されたのと同じデバイスでアクセスすることも、他の承認されたデバイスを使用してアクセスすることもできます。完成した電子同意のコピーには、署名を検証するためにここからアクセスできます。
次に、コーディネーターは、同意の種類を含む他の関連セクションに記入し、この青いセクションでは、症例外科医、それが実行された場所、収集日、およびその他の関連情報など、症例自体の詳細を記入します。この次のグリーン患者セクションには、サンプルMRN、患者の姓名、性別、年齢の自動計算による生年月日、影響を受けた目の側近性、診断カテゴリなど、患者の人口統計があります。このフォームは分岐ロジックを備えているため、チェックボックスを選択すると、その下のチェックボックスの外観に影響します。
この場合、これは前眼部と網膜の症例です。したがって、最初に、診断網膜ボックスが入力されます。コーディネーターは、これが黄斑円孔であり、前眼部診断ボックスも入力されていることを選択しました。
この場合、白内障のように見えます。事前操作履歴フォームもフリーテキストボックスとして入力されます。ここでは、EMRからの情報をコピーして貼り付けたり、将来の参照のために手術前の履歴に関する新しい情報を入力したりできます。
次に、この赤いセクションに、手順ボックスがあります。この場合、扁平硝子体切除術がファコIOLと一緒に選択されたように見えます。これらのチェックボックスのいずれにも入力されていないものはすべて、フォーム全体にちりばめられているこれらの他のボックスを使用してフリーテキストで入力できます。
ケース自体に関する関連する詳細も完了しています。最後に、このゴールドセクションには、収集エリアがあります。検体を採取するコーディネーターの名前と、使用されている検体チューブの数がここに入力されています。
ここでも、分岐ロジックを使用して、ケースに必要な数のサンプルを収集できます。この場合、2つのサンプルが収集され、硝子体コアと前房液サンプルのように見える。これらの各サンプルのバーコードはここでスキャンされ、フォームに記録されています。
最後に、サンプルコレクションノートセクションがあり、コーディネーターは、引き出された流体の量や品質など、関連する詳細を入力できます。この最後のファイルアップロードセクションでは、関連する写真、ビデオ、またはドキュメントをフォーム自体にアップロードしてリンクできます。最後に、すべてが完了したら、コーディネーターは[次へ送信]をクリックすると、すべての関連情報が保存された状態でフォームが保存され、サンプルが患者と正常につながります。
ドライアイスでサンプルを手術室からラボに輸送します。ラボのコンピューターで REDCap にログインします。収集したサンプルの1つを取り、バーコードをスキャンしてデータベースに入力します。
次に、ドライアイスが入った2番目の容器とクライオバイアル用のラックが必要です。ラックのバーコードもデータベースにスキャンされ、サンプルがラックに転送されます。ラック内のバイアルの位置がデータベースに追加され、エントリが保存されて閉じられます。
次に、バイアルの入ったラックをドライアイスで冷蔵庫に運び、マイナス80°Cで保管します。ラックは、座標系を使用して冷蔵庫内の特定の位置に追加されます。これにより、後で下流の分析のためにサンプルを簡単に取得できます。
このビデオは、サンプル ストレージ フォームのチュートリアルです。ここに、患者概要レコードが表示されます。この緑色の円は、サンプルコレクション入力フォームがすでに入力されていることを示します。
この空の円は、保管フォームに記入する必要があることを示します。保管フォームは、入力フォームの段階で収集されたサンプルごとに記入する必要があります。この円をクリックすると、最初のサンプルストレージフォームに移動します。
ここでは、PID が生成され、MRN がマスクされていることがわかります。その情報は引き続きアクセスでき、入力フォームの緑色の円をクリックすると、前のページを使用してアクセスできます。このページが完了すると、標本のスナップショットが生成されます。
コレクションノートの下に、情報が入力フォームから自動インポートされていることがわかります。次に、[レコードのアーカイブ日]の下に、このフォームに記入する日付を入力できます。検体チューブのバーコードで、アーカイブされているチューブのバーコードをスキャンまたは再入力します。
リアルタイムで、この標本のスナップショットは更新されています。このセクションでは、サンプルを転送するかどうかを選択できます。ここでは、その関連情報を入力します。
この例では、これが内部のバイオリポジトリストレージに入るサンプルであることを示します。検証中、研究コーディネーターは戻って、電子同意または紙の同意が正常にプロトコル内で完了したことを確認できます。この検証を完了する人の名前が入力され、このドロップダウンを使用して、検証者はここのバーコードを入力したばかりのバーコードと照合します。
これにより、精度が保証されます。次に、このロケーションフェーズでは、サンプルが保管される冷凍庫が表示されます。サンプルが保管される棚を指定したり、スキャンまたは入力できるボックスバーコードを記録したりできます。
ここにボックスラベルを入力することもでき、ラベルをボックスに配置してさらに一致させることができます。次に、行と列ごとの2つの位置の両方が記録されます。これにより、すべてのバーコードがボックス内の位置に関連付けられ、将来簡単に取得できるように記録されます。
この使用法セクションでは、プロジェクト名を入力するか、ドロップダウンボックスからプロジェクト名を選択できます。試料の体積を記録します。ここでは、このフォームに最後にアクセスした日時とユーザーが自動入力され、必要に応じて確認および監査できる一連の管理が確保されます。
フォームをアーカイブする人は、ここに自分の名前を入力し、保存のためにこの入力フォームに記録したい内容と一致する可能性のある関連するメモをここに示します。最後に、ファイルをアップロードするための別のセクションがあり、これがすべて完了したら、[保存して終了]をクリックしてこのフォームに記入して送信でき、患者の概要に戻ります。記入する必要がある追加のフォームごとに、保存する必要のあるチューブごとに、このプラスボタンをクリックしてサンプル保存フォームに戻り、別のレコードを生成できます。
この概要では、生成された入力フォームと、この患者レコードの後続の保存フォームにアクセスできます。このようにして、REDCap 内でバックエンド アクセスやその他の特定のアクセス許可を持つユーザーなら誰でも簡単に取得してアクセスできます。採取したリキッドバイオプシーは、プロテオミクス、グライコミクス、メタボロミクスなど様々な分子解析に供することができます。
REDCapデータベースを使用すると、特定の疾患の患者からのサンプルを検索するなどして、サンプルを簡単かつ迅速に取得できます。症例は17歳の女性で,免疫不全で網膜神経と視神経の炎症を呈した症例である。感染が懸念されたため、房水リキッドバイオプシーを実施し、DNA PCR分析に送りました。
結果はCMVに対して陽性であり、HSVおよびトキソプラズマ症に対して陰性であり、感染性型と非感染型の眼内炎症を区別し、適切な治療法を選択するために重要でした。液体クロマトグラフィー質量分析は、プロテオームの偏りのない半定量分析を可能にします。硝子体切除術を受けた患者の硝子体からのリキッドバイオプシーでは、補体C3、オプティシン、コラーゲン2型を含む484のユニークなタンパク質を特定することができました。
3つの硝子体液生検を、グライコプロテオミクスマルチプレックスアナライザーを用いて分析した。このアッセイでは、500のヒトタンパク質のグリコシル化プロファイルを検出し、代謝、免疫応答、細胞接着、アクチン組織化などのさまざまな生物学的経路を捉えました。また、房水リキッドバイオプシーのメタボロミクスプロファイルを特殊な質量分析法を用いて解析した。
3つの水性ヒトリキッドバイオプシーで292種類の代謝物を同定した。経路解析により、アミノ酸代謝、尿循環、カルニチン合成など、さまざまな代謝経路が特定されました。結論として、私たちのワークフローは、手術室と研究室の間に実用的なインターフェースを確立し、高品質の手術標本の標準化されたハイスループットの収集、注釈付け、および保管を可能にしました。
サンプルは、プロテオミクス、グライコミクス、メタボローム研究などの分子ダウンストリーム分析に使用できます。私たちのプロトコルは、将来のトランスレーショナルリサーチのための貴重な基盤を提供します。
