El perfil molecular de biopsias líquidas del ojo humano puede capturar fluidos enriquecidos localmente que contienen miles de moléculas diferentes de tejidos oculares altamente especializados. Permiten la caracterización molecular de enfermedades oculares en humanos vivos y de mayor potencial para identificar nuevas estrategias diagnósticas y terapéuticas. Aquí desarrollamos un protocolo para la recolección estandarizada y biobanco de biopsias líquidas vítreas y de humor acuoso de alta calidad durante la cirugía intraocular.
Parte del protocolo es una base de datos compatible con la privacidad de datos basada en la web para anotar cada muestra a lo largo de su vida útil y el uso de un sistema de coordenadas que permite rastrear la ubicación de cada muestra con código de barras en el almacenamiento, lo que permite una recuperación eficiente de muestras para experimentos posteriores como análisis de proteínas, glicanos y metabolitos. Use un microscopio quirúrgico para realizar una paracentesis de cámara anterior perpendicular al limbo utilizando una aguja de calibre 30 a 32 conectada a una jeringa de un ml. Se puede usar una punta de algodón para estabilizar el ojo durante este procedimiento.
Asegúrese de que la punta de la aguja permanezca sobre el iris periférico en la cámara anterior media para evitar daños en las estructuras intraoculares. Bajo visualización directa a través del microscopio, aspire manualmente aproximadamente cien microlitros de humor acuoso sin diluir con una jeringa de un ml. Luego, la aguja se retira cuidadosamente de la cámara anterior.
En un ojo fáquico, mantenga la aguja sobre el iris para evitar tocar la lente. La presión positiva sobre el globo puede aumentar el reflujo. Liberar la punta de algodón antes de retirar la aguja ayuda a reducir el reflujo.
Tire hacia atrás del plomero y vea cómo se mueve el aire y el fluido recogido. Inyecte la jeringa en el vial criogénico. El aire adicional despeja el espacio muerto de la jeringa.
Aquí puede ver el código de barras que está grabado permanentemente en el vial. El código de barras se utiliza para escanear la muestra al formulario REDCap en una computadora en la sala de operaciones. El vial criogénico se transferirá inmediatamente en hielo seco en la caja de enfriamiento.
Las biopsias líquidas vítreas se pueden obtener al comienzo de una vitrectomía por un cirujano vitreorretiniano capacitado. Tenga en cuenta que el cortador de vitrectomía no se cebará con líquido. En la cavidad vítrea, active el cortador vítreo sin perfusión para recoger una muestra vítrea sin diluir.
Aspirar manualmente de 0,5 a un ml de vítreo con una jeringa conectada a la cánula de extrusión vítrea. Luego, la muestra se procesa como demostramos para una muestra humeral precisa. Este video es un tutorial de un formulario de recolección de muestras completado en REDCap en la vista de encuesta.
Una vez que un paciente completa el consentimiento electrónico con la ayuda de un coordinador de investigación clínica, este formulario se rellena. Se puede acceder a él en el mismo dispositivo en el que el paciente recibió su consentimiento electrónico, o se puede acceder utilizando cualquier otro dispositivo aprobado. Se puede acceder a una copia del consentimiento electrónico que se completó aquí para verificar las firmas.
Luego, el coordinador completa las otras secciones relevantes, incluido el tipo de consentimiento y, en esta sección azul, detalles sobre el caso en sí, como el cirujano del caso, dónde se realizó, la fecha de la recopilación y otra información relevante. En esta siguiente sección verde de pacientes, tenemos datos demográficos del paciente, que incluyen una muestra de MRN, el nombre y apellido del paciente, su sexo, fecha de nacimiento con un cálculo automático de la edad, la lateralidad del ojo afectado y la categoría de diagnóstico. Este formulario presenta lógica de bifurcación, por lo que cuando se selecciona una casilla de verificación, afecta a la apariencia de las casillas de verificación debajo de ella.
En este caso, este es un segmento anterior y un caso de retina. Entonces, primero, se llena la caja de retina de diagnóstico. El coordinador ha seleccionado que se trata de un agujero macular y también se ha rellenado el cuadro de diagnóstico del segmento anterior.
En este caso, parece que es una catarata. Un formulario de historial preoperatorio también se rellena como un cuadro de texto libre. Aquí, la información del EMR se puede copiar y pegar o se puede ingresar nueva información sobre el historial preoperatorio para referencia futura.
A continuación, en esta sección roja, tenemos el cuadro de procedimiento. En este caso, parece que se seleccionó una vitrectomía pars plana junto con la LIO de un faro. Cualquier cosa que no se rellene aquí en ninguna de estas casillas de verificación se puede ingresar en texto libre usando estas otras casillas que están salpicadas en todo el formulario.
También se completan los detalles relevantes sobre el caso en sí. Por último, en esta sección de oro, tenemos un área de recolección. Aquí se ha introducido el nombre del coordinador que recoge la muestra junto con el número de tubos de muestra que se utilizan.
Una vez más, utilizando la lógica de ramificación, podemos recolectar tantas muestras como sea necesario para el caso. En este caso, se recogieron dos muestras, parece un núcleo vítreo y una muestra de líquido de la cámara anterior. Los códigos de barras de cada una de estas muestras se han escaneado aquí y se han registrado en el formulario.
Finalmente, hay una sección de notas de recolección de muestras donde el coordinador puede escribir detalles relevantes, incluidos los volúmenes y la calidad del fluido extraído. En esta sección final de carga de archivos, cualquier foto, video o documentación relevante se puede cargar en el formulario y vincular. Finalmente, una vez que todo está completo, el coordinador puede hacer clic en enviar siguiente y el formulario se guarda con toda la información relevante almacenada, conectando la muestra con éxito con el paciente.
Transporte las muestras en hielo seco desde el quirófano hasta el laboratorio. Inicie sesión en REDCap en el equipo del laboratorio. Tome una de las muestras recogidas y escanee el código de barras en la base de datos.
Ahora, se necesita un segundo recipiente con hielo seco y un estante para los viales criogénicos. El código de barras del rack también se escaneará a la base de datos y las muestras se transferirán al rack. La posición de los viales en el bastidor se agrega a la base de datos y la entrada se guarda y se cierra.
La rejilla con los viales se transporta en hielo seco al refrigerador para su almacenamiento a menos 80 grados centígrados. La rejilla se añade a una posición específica en el frigorífico mediante un sistema de coordenadas. Esto permitirá recuperar fácilmente muestras para el análisis posterior.
Este vídeo es un tutorial del formulario de almacenamiento de ejemplo. Aquí, vemos el registro general del paciente. Este círculo verde indica que el formulario de entrada de recolección de muestras ya se ha completado.
Este círculo vacío indica que se debe completar un formulario de almacenamiento. Se debe completar un formulario de almacenamiento para cada muestra que se recolecte durante la fase del formulario de inscripción. Al hacer clic en este círculo, accederemos al primer formulario de almacenamiento de muestras.
Aquí podemos ver que se ha generado un PID y se ha enmascarado el MRN. Esa información sigue siendo accesible y se puede acceder a ella utilizando la página anterior haciendo clic en el círculo verde en el formulario de inscripción. Aquí se generará una instantánea de muestra una vez que se complete esta página.
En las notas de recopilación, vemos que la información se ha importado automáticamente desde el formulario de inscripción. A continuación, en la fecha de archivo del registro, podemos ingresar la fecha en que se completa este formulario. Bajo el código de barras del tubo de muestra, escaneamos o volvemos a ingresar el código de barras del tubo que se está archivando.
En tiempo real, esta instantánea de muestra se está actualizando. En esta sección, podemos seleccionar si se está transfiriendo una muestra. Aquí ingresamos esa información relevante.
Por el bien de este ejemplo, vamos a indicar que esta es una muestra que va al almacenamiento interno del biorepositorio. Bajo verificación, un coordinador de investigación puede regresar y verificar que el consentimiento electrónico o el consentimiento en papel se completó con éxito y dentro de los protocolos. Se ingresa el nombre de la persona que completa esta verificación y, utilizando este menú desplegable, el verificador hace coincidir el código de barras aquí con lo que se acaba de escribir.
Esto garantiza la precisión. A continuación, en esta fase de localización, vemos el congelador donde se va a almacenar la muestra. Podemos indicar el estante donde se almacenará la muestra, así como registrar el código de barras de la caja, que se puede escanear o escribir.
También se puede escribir una etiqueta de caja aquí y la etiqueta se puede colocar en la caja para una mayor coincidencia. Luego se registran las dos posiciones por fila y columna. Esto garantiza que cada código de barras esté asociado con una posición dentro de la caja que se registre para recuperarlo fácilmente en el futuro.
En esta sección de uso, podemos ingresar el nombre de nuestro proyecto o seleccionar uno de un cuadro desplegable. Registre el volumen de la muestra. Y aquí, la fecha y la hora, así como el usuario que accedió por última vez a este formulario, se rellenan automáticamente para garantizar una cadena de custodia que se puede revisar y auditar según sea necesario.
La persona que archiva el formulario ingresa su nombre aquí e indica cualquier nota relevante aquí que pueda ser consistente con lo que desea registrar dentro de este formulario de entrada para su almacenamiento. Finalmente, hay otra sección para cargar un archivo, y una vez que todo esto se completa, este formulario se puede completar y enviar haciendo clic en guardar y salir, lo que nos lleva de vuelta a la descripción general del paciente. Por cada formulario adicional que se debe completar, por cada tubo que se debe almacenar, podemos hacer clic en este botón más para volver al formulario de almacenamiento de muestras y generar otro registro.
Esta descripción general proporciona un acceso al formulario de entrada que se generó, así como a cualquier formulario de almacenamiento posterior para este registro del paciente. De esta manera, es fácilmente recuperable y accesible para cualquier persona con acceso de backend u otros permisos otorgados dentro de un REDCap. Las biopsias líquidas recolectadas pueden someterse a una variedad de análisis moleculares que incluyen proteómica, glucómica y metabolómica.
La base de datos REDCap permite la recuperación simple y rápida de muestras, por ejemplo, mediante la búsqueda de muestras de pacientes con una enfermedad específica. Se trata de una paciente de 17 años que estaba inmunocomprometida y que presentaba inflamación retiniana y del nervio óptico. Preocupado por una infección, se realizó una biopsia líquida de humor acuoso y se envió para el análisis de PCR de ADN.
Los resultados fueron positivos para CMV y negativos para HSV y toxoplasmosis y fueron críticos para distinguir las formas infecciosas de no infecciosas de inflamación intraocular y seleccionar la terapia apropiada. La cromatografía líquida de espectrometría de masas permite un análisis imparcial y semicuantitativo del proteoma. En una biopsia líquida del vítreo de un paciente sometido a vitrectomía, la técnica fue capaz de identificar 484 proteínas únicas, incluyendo complemento C3, óptica y colágeno tipo 2.
Se analizaron tres biopsias líquidas vítreas utilizando un analizador multiplex de glicoproteómica. El ensayo detectó los perfiles de glicosilación de 500 proteínas humanas, capturando una variedad de vías biológicas como el metabolismo, la respuesta inmune, la adhesión celular y la organización de la actina. También analizamos el perfil metabolómico de biopsias líquidas de humor acuoso utilizando una forma especial de espectrometría de masas.
Se identificaron 292 metabolitos diferentes en tres biopsias líquidas humanas acuosas. Un análisis de la vía identificó una variedad de vías metabólicas que incluyen el metabolismo de los aminoácidos, el ciclo de uria y la síntesis de carnitina. En conclusión, nuestro flujo de trabajo estableció una interfaz práctica entre el quirófano y el laboratorio de investigación que permite la recolección, anotación y almacenamiento estandarizados y de alto rendimiento de muestras quirúrgicas de alta calidad.
Las muestras se pueden utilizar para análisis moleculares posteriores, incluidos estudios proteómicos, glucómicos y metabolómicos. Nuestro protocolo proporciona una base valiosa para futuras investigaciones traslacionales.
