Die molekulare Profilierung von Flüssigbiopsien aus dem menschlichen Auge kann lokal angereicherte Flüssigkeiten erfassen, die Tausende verschiedener Moleküle aus hochspezialisiertem Augengewebe enthalten. Sie ermöglichen die molekulare Charakterisierung von Augenerkrankungen beim lebenden Menschen und haben darüber hinaus das Potenzial, neue diagnostische und therapeutische Strategien zu identifizieren. Hier haben wir ein Protokoll für die standardisierte Entnahme und Biobank von hochwertigen Kammerwasser- und Glaskörper-Flüssigbiopsien während der intraokularen Chirurgie entwickelt.
Teil des Protokolls ist eine webbasierte, datenschutzkonforme Datenbank, um jede Probe während ihrer Lebensdauer mit Anmerkungen zu versehen, und die Verwendung eines Koordinatensystems, das es ermöglicht, den Standort jeder mit Barcode versehenen Probe im Lager zu verfolgen, was einen effizienten Probenabruf für nachgelagerte Experimente wie Protein-, Glykan- und Metabolitenanalysen ermöglicht. Verwenden Sie ein Operationsmikroskop, um eine Vorderkammerparazentese senkrecht zum Limbus mit einer 30- bis 32-Gauge-Nadel durchzuführen, die mit einer Ein-ml-Spritze verbunden ist. Eine Wattestäbchen kann verwendet werden, um das Auge während dieses Eingriffs zu stabilisieren.
Achten Sie darauf, dass die Nadelspitze über der peripheren Iris in der mittleren Vorderkammer bleibt, um Schäden an den intraokularen Strukturen zu vermeiden. Unter direkter Visualisierung über das Mikroskop werden etwa hundert Mikroliter unverdünntes Kammerwasser mit einer Ein-ml-Spritze manuell abgesaugt. Anschließend wird die Nadel vorsichtig aus der Vorderkammer entfernt.
Halten Sie die Nadel bei einem phaken Auge über die Iris, um zu vermeiden, dass die Linse berührt wird. Überdruck auf den Globus kann den Reflux verstärken. Das Loslassen der Wattestäbchenspitze, bevor die Nadel zurückgezogen wird, hilft, Reflux zu reduzieren.
Ziehen Sie den Klempner zurück und sehen Sie, wie sich die Luft und die gesammelte Flüssigkeit bewegen. Injizieren Sie die Spritze in die Kryo-Durchstechflasche. Die zusätzliche Luft befreit den Totraum der Spritze.
Hier sehen Sie den Barcode, der dauerhaft auf das Fläschchen geätzt ist. Der Barcode wird dann verwendet, um die Probe auf einem Computer im Operationssaal in das REDCap-Formular zu scannen. Das Kryofläschchen wird sofort auf Trockeneis in die Kühlbox überführt.
Glaskörper-Flüssigbiopsien können zu Beginn einer Vitrektomie von einem ausgebildeten vitreoretinalen Chirurgen angefertigt werden. Beachten Sie, dass der Vitrektomieschneider nicht mit Flüssigkeit grundiert wird. Aktivieren Sie in der Glaskörperhöhle den Glaskörperschneider ohne Infusion, um eine unverdünnte Glaskörperprobe zu entnehmen.
Saugen Sie manuell 0,5 bis einen ml Glaskörper mit einer Spritze ab, die mit der Glaskörper-Extrusionskanüle verbunden ist. Die Probe wird dann so aufbereitet, wie wir es für eine genaue Humerusprobe demonstriert haben. Dieses Video ist eine exemplarische Vorgehensweise für ein ausgefülltes Probenerfassungsformular in REDCap in der Umfrageansicht.
Sobald ein Patient die elektronische Einwilligung mit Unterstützung eines Koordinators für klinische Forschung ausgefüllt hat, wird dieses Formular ausgefüllt. Der Zugriff kann auf demselben Gerät erfolgen, auf dem der Patient seine elektronische Einwilligung erhalten hat, oder er kann mit jedem anderen zugelassenen Gerät aufgerufen werden. Eine Kopie der ausgefüllten elektronischen Einwilligung kann hier abgerufen werden, damit die Unterschriften überprüft werden können.
Der Koordinator füllt dann die anderen relevanten Abschnitte aus, einschließlich der Art der Einwilligung, und in diesem blauen Abschnitt Details zum Fall selbst, wie z. B. den Fallchirurgen, den Ort, an dem sie durchgeführt wurde, das Datum der Entnahme und andere relevante Informationen. In diesem nächsten grünen Patientenabschnitt haben wir demografische Patientendaten, einschließlich einer Stichprobe-MRN, des Vor- und Nachnamens des Patienten, seines Geschlechts, seines Geburtsdatums mit einer automatischen Berechnung des Alters, der Lateralität des betroffenen Auges und der diagnostischen Kategorie. Dieses Formular verfügt über eine Verzweigungslogik, d. h., wenn ein Kontrollkästchen ausgewählt ist, wirkt sich dies auf das Erscheinungsbild der darunter liegenden Kontrollkästchen aus.
In diesem Fall handelt es sich um einen Fall des vorderen Augenabschnitts und der Netzhaut. Zuerst wird also die Diagnose-Retina-Box befüllt. Der Koordinator hat ausgewählt, dass es sich um ein Makulaforamen handelt, und das Diagnosefeld für den vorderen Augenabschnitt wurde ebenfalls ausgefüllt.
In diesem Fall sieht es so aus, als ob es sich um einen Grauen Star handelt. Ein Formular für den Verlauf vor dem Vorgang wird auch als Freitextfeld ausgefüllt. Hier können Informationen aus der EMR kopiert und eingefügt oder neue Informationen zur Vorgeschichte eingegeben werden, um später darauf zurückgreifen zu können.
Als nächstes haben wir in diesem roten Abschnitt das Verfahrensfeld. In diesem Fall sieht es so aus, als ob eine Pars-Plana-Vitrektomie zusammen mit einer Phako-IOL ausgewählt wurde. Alles, was hier in keinem dieser Kontrollkästchen ausgefüllt ist, kann mit diesen anderen Feldern, die im gesamten Formular verteilt sind, in Freitext eingegeben werden.
Relevante Details zum Fall selbst werden ebenfalls vervollständigt. Schließlich haben wir in dieser Goldabteilung einen Sammelbereich. Hier sind der Name des Koordinators, der die Probe entnimmt, sowie die Anzahl der verwendeten Probenröhrchen eingetragen.
Auch hier können wir mithilfe der Verzweigungslogik so viele Stichproben sammeln, wie für den Fall erforderlich sind. In diesem Fall wurden zwei Proben entnommen, die wie ein Glaskörperkern und eine Vorderkammerflüssigkeitsprobe aussehen. Die Barcodes jeder dieser Proben wurden hier eingescannt und in das Formular aufgenommen.
Schließlich gibt es einen Abschnitt mit Notizen zur Probenentnahme, in den der Koordinator relevante Details wie Volumen und Qualität der entnommenen Flüssigkeit eingeben kann. In diesem letzten Abschnitt zum Hochladen von Dateien können alle relevanten Fotos, Videos oder Dokumentationen in das Formular selbst hochgeladen und verlinkt werden. Sobald alles erledigt ist, kann der Koordinator auf "Weiter senden" klicken und das Formular wird mit allen relevanten Informationen gespeichert, wodurch die Probe erfolgreich mit dem Patienten verbunden wird.
Transportieren Sie die Proben auf Trockeneis vom Operationssaal ins Labor. Loggen Sie sich auf dem Laborrechner in REDCap ein. Entnehmen Sie eine der entnommenen Proben und scannen Sie den Barcode in die Datenbank.
Nun wird ein zweiter Behälter mit Trockeneis und ein Gestell für die Kryofläschchen benötigt. Der Barcode des Racks wird ebenfalls in die Datenbank gescannt und die Proben werden in das Rack übertragen. Die Position der Vials im Rack wird der Datenbank hinzugefügt und der Eintrag wird gespeichert und geschlossen.
Das Gestell mit den Fläschchen wird dann auf Trockeneis in den Kühlschrank transportiert und dort bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Der Rost wird mithilfe eines Koordinatensystems an einer bestimmten Position im Kühlschrank angebracht. Dies ermöglicht später die einfache Entnahme von Proben für die nachgelagerte Analyse.
Dieses Video ist eine exemplarische Vorgehensweise für das Musterspeicherformular. Hier sehen wir den Patientenübersichtsdatensatz. Dieser grüne Kreis zeigt an, dass das Anmeldeformular für die Probenentnahme bereits ausgefüllt wurde.
Dieser leere Kreis zeigt an, dass ein Lagerformular ausgefüllt werden muss. Für jede Probe, die während der Einreichungsphase entnommen wird, muss ein Aufbewahrungsformular ausgefüllt werden. Wenn Sie auf diesen Kreis klicken, gelangen Sie zum ersten Musterspeicherformular.
Hier können wir sehen, dass eine PID generiert wurde und die MRN maskiert wurde. Diese Informationen sind weiterhin zugänglich und können über die vorherige Seite aufgerufen werden, indem Sie auf den grünen Kreis im Anmeldeformular klicken. Hier wird ein Schnappschuss erstellt, sobald diese Seite abgeschlossen ist.
Unter den Erfassungsnotizen sehen wir, dass die Informationen automatisch aus dem Eingabeformular importiert wurden. Als nächstes können wir unter Archivierungsdatum des Datensatzes das Datum eingeben, an dem dieses Formular ausgefüllt wird. Unter Probenröhrchen-Barcode scannen wir den Barcode des zu archivierenden Röhrchens oder geben ihn erneut ein.
In Echtzeit wird dieser Proben-Snapshot aktualisiert. In diesem Abschnitt können wir auswählen, ob eine Probe übertragen werden soll. Hier geben wir die relevanten Informationen ein.
In diesem Beispiel werden wir darauf hinweisen, dass es sich um eine Probe handelt, die in den internen Biorepository-Speicher verschoben wird. Bei der Überprüfung kann ein Forschungskoordinator zurückgehen und überprüfen, ob die elektronische Einwilligung oder die Papiereinwilligung erfolgreich und innerhalb der Protokolle abgeschlossen wurde. Der Name der Person, die diese Verifizierung durchführt, wird eingegeben, und mithilfe dieser Dropdown-Liste gleicht der Verifizierer den Barcode hier mit dem ab, was gerade eingegeben wurde.
Dies gewährleistet die Genauigkeit. Als nächstes sehen wir in dieser Lokalisierungsphase den Gefrierschrank, in dem die Probe gelagert werden soll. Wir können das Regal angeben, in dem die Probe gelagert wird, sowie den Box-Barcode aufzeichnen, der gescannt oder eingetippt werden kann.
Hier kann auch ein Kartonetikett eingegeben werden, das zum weiteren Abgleich auf dem Karton platziert werden kann. Dann werden die beiden Positionen nach Zeile und Spalte aufgezeichnet. Dadurch wird sichergestellt, dass jeder Barcode einer Position innerhalb des Kartons zugeordnet ist, die für einen einfachen Abruf in der Zukunft aufgezeichnet wird.
In diesem Verwendungsabschnitt können wir unseren Projektnamen eingeben oder einen aus einer Dropdown-Box auswählen. Notieren Sie das Probenvolumen. Und hier werden Datum und Uhrzeit sowie der Benutzer, der zuletzt auf dieses Formular zugegriffen hat, automatisch ausgefüllt, um eine Kontrollkette zu gewährleisten, die bei Bedarf überprüft und geprüft werden kann.
Die Person, die das Formular archiviert, gibt hier ihren Namen ein und gibt hier alle relevanten Notizen an, die möglicherweise mit dem übereinstimmen, was sie in diesem Eingabeformular zur Speicherung aufzeichnen möchte. Schließlich gibt es noch einen weiteren Abschnitt zum Hochladen einer Datei, und sobald all dies abgeschlossen ist, kann dieses Formular ausgefüllt und abgeschickt werden, indem Sie auf Speichern und Beenden klicken, was uns zurück zur Patientenübersicht bringt. Für jedes weitere Formular, das ausgefüllt werden muss, für jedes Röhrchen, das gespeichert werden muss, können wir auf diese Plus-Schaltfläche klicken, um zum Musterspeicherformular zurückzukehren und einen weiteren Datensatz zu generieren.
Diese Übersicht bietet einen Zugriff auf das generierte Erfassungsformular sowie in eventuelle nachfolgende Ablageformulare zu dieser Patientenakte. Auf diese Weise ist es leicht abrufbar und für jeden zugänglich, der Backend-Zugriff oder andere Berechtigungen innerhalb eines REDCap hat. Die gesammelten Flüssigbiopsien können einer Vielzahl von molekularen Analysen unterzogen werden, darunter Proteomik, Glykomik und Metabolomik.
Die Datenbank REDCap ermöglicht ein einfaches und schnelles Auffinden von Proben, z. B. durch die Suche nach Proben von Patienten mit einer bestimmten Erkrankung. Es handelt sich um eine 17-jährige Patientin, die immungeschwächt war und eine Entzündung der Netzhaut und des Sehnervs aufwies. Aus Sorge vor einer Infektion wurde eine Kammerwasser-Flüssigbiopsie durchgeführt und zur DNA-PCR-Analyse geschickt.
Die Ergebnisse waren positiv für CMV und negativ für HSV und Toxoplasmose und waren entscheidend für die Unterscheidung infektiöser von nicht-infektiösen Formen der intraokularen Entzündung und die Auswahl der geeigneten Therapie. Die Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie ermöglicht eine unvoreingenommene und semiquantitative Analyse des Proteoms. In einer Flüssigbiopsie aus dem Glaskörper eines Patienten, der sich einer Vitrektomie unterzog, konnte die Technik 484 einzigartige Proteine identifizieren, darunter Komplement C3, Optik und Kollagen Typ 2.
Drei Glaskörper-Flüssigbiopsien wurden mit einem Glykoproteomik-Multiplex-Analysator analysiert. Der Assay detektierte die Glykosylierungsprofile von 500 menschlichen Proteinen und erfasste eine Vielzahl biologischer Signalwege wie Stoffwechsel, Immunantwort, Zelladhäsion und Aktinorganisation. Wir analysierten auch das Metabolomics-Profil von Kammerwasser-Flüssigbiopsien mit einer speziellen Form der Massenspektrometrie.
Wir identifizierten 292 verschiedene Metaboliten in drei wässrigen humanen Flüssigbiopsien. Eine Signalweganalyse identifizierte eine Vielzahl von Stoffwechselwegen, darunter den Aminosäurestoffwechsel, den Harnzyklus und die Carnitinsynthese. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass unser Workflow eine praktische Schnittstelle zwischen dem Operationssaal und dem Forschungslabor geschaffen hat, die eine standardisierte Erfassung, Annotation und Lagerung von hochwertigen chirurgischen Proben mit hohem Durchsatz ermöglicht.
Die Proben können für molekulare Downstream-Analysen verwendet werden, einschließlich Proteomik-, Glykomik- und Metabolomik-Studien. Unser Protokoll bietet eine wertvolle Grundlage für zukünftige translationale Forschung.
