인간의 눈에서 얻은 액체 생검의 분자 프로파일링은 고도로 전문화된 안구 조직에서 수천 개의 서로 다른 분자를 포함하는 국소 농축 유체를 캡처할 수 있습니다. 이를 통해 살아있는 인간의 안구 질환에 대한 분자적 특성화와 새로운 진단 및 치료 전략을 식별할 수 있는 추가 잠재력을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 안내 수술 중 고품질 방수와 유리체 액체 생검의 표준화된 수집 및 바이오뱅킹을 위한 프로토콜을 개발했습니다.
프로토콜의 일부는 수명 기간 동안 각 샘플에 주석을 달기 위한 웹 기반 데이터 개인 정보 보호 준수 데이터베이스와 스토리지에서 각 바코드 샘플의 위치를 추적할 수 있는 좌표계를 사용하여 단백질, 글리칸 및 대사 산물 분석과 같은 다운스트림 실험을 위한 효율적인 샘플 검색을 가능하게 합니다. 작동 현미경을 사용하여 1ml 주사기에 연결된 30-32 게이지 바늘을 사용하여 윤부에 수직인 전방 천자를 수행합니다. 이 과정에서 면봉을 사용하여 눈을 안정시킬 수 있습니다.
안구 구조의 손상을 방지하기 위해 바늘 끝이 중간 전방의 주변 홍채 위에 남아 있는지 확인하십시오. 현미경을 통한 직접 시각화 하에서 1ml 주사기를 사용하여 약 100마이크로리터의 희석되지 않은 방수를 수동으로 흡인합니다. 그런 다음 바늘을 전방에서 조심스럽게 제거합니다.
phakic 눈에서는 렌즈를 만지지 않도록 바늘을 홍채 위에 두십시오. 지구에 대한 양압은 역류를 증가시킬 수 있습니다. 바늘을 빼기 전에 면봉을 풀어주면 역류를 줄이는 데 도움이 됩니다.
배관공을 뒤로 당기고 공기와 수집된 유체가 어떻게 움직이는지 확인하십시오. 주사기를 극저온 바이알에 주입합니다. 여분의 공기는 주사기 데드 스페이스를 청소합니다.
여기에서 바이알에 영구적으로 새겨진 바코드를 볼 수 있습니다. 그런 다음 바코드를 사용하여 수술실에 있는 컴퓨터의 REDCap 양식으로 샘플을 스캔합니다. 극저온 바이알은 즉시 냉각 상자의 드라이아이스로 옮겨집니다.
유리체 액체 생검은 훈련된 유리체 망막 외과의가 유리체 절제술을 시작할 때 얻을 수 있습니다. 유리체 절제술 절단기는 액체로 프라이밍되지 않습니다. 유리체 구멍에서 주입 없이 유리체 절단기를 활성화하여 희석되지 않은 유리체 샘플을 수집합니다.
유리체 압출 캐뉼라에 연결된 주사기를 사용하여 0.5 내지 1ml의 유리체를 수동으로 흡인한다. 그런 다음 정확한 상완골 표본을 위해 시연한 대로 샘플을 처리합니다. 이 비디오는 현장조사 보기에서 REDCap의 완성된 샘플 수집 양식을 연습하는 것입니다.
환자가 임상 연구 코디네이터의 도움을 받아 전자 동의를 완료하면 이 양식이 채워집니다. 환자가 전자 동의를 받은 것과 동일한 장치에서 액세스하거나 다른 승인된 장치를 사용하여 액세스할 수 있습니다. 완료된 전자 동의서 사본은 여기에서 액세스하여 서명을 확인할 수 있습니다.
그런 다음 코디네이터는 동의 유형을 포함한 기타 관련 섹션을 작성하고 이 파란색 섹션에는 사례 외과의, 수행 장소, 수집 날짜 및 기타 관련 정보와 같은 사례 자체에 대한 세부 정보를 작성합니다. 이 다음 녹색 환자 섹션에는 샘플 MRN, 환자의 이름과 성, 성별, 연령 자동 계산을 통한 생년월일, 영향을 받은 눈의 편측성 및 진단 범주를 포함한 환자 인구 통계가 있습니다. 이 양식에는 분기 논리가 있으므로 확인란을 선택하면 그 아래에 있는 확인란의 모양에 영향을 줍니다.
이 경우 이것은 전안부와 망막의 경우입니다. 그래서 먼저 진단 망막 상자가 채워집니다. 코디네이터는 이것이 황반 구멍임을 선택했으며 전안부 진단 상자도 채워졌습니다.
이 경우 백내장처럼 보입니다. 작업 전 기록 양식도 자유 텍스트 상자로 채워집니다. 여기에서 EMR의 정보를 복사하여 붙여넣거나 나중에 참조할 수 있도록 수술 전 기록에 대한 새로운 정보를 입력할 수 있습니다.
다음으로 이 빨간색 섹션에는 절차 상자가 있습니다. 이 경우, 유리체 절제술이 phaco IOL과 함께 선택된 것처럼 보입니다. 이러한 확인란에 채워지지 않은 항목은 양식 전체에 뿌려진 다른 상자를 사용하여 자유 텍스트로 입력할 수 있습니다.
사례 자체에 대한 관련 세부 정보도 완료됩니다. 마지막으로 이 금 섹션에는 수집 영역이 있습니다. 여기에 사용 중인 검체 튜브의 수와 함께 검체를 수집하는 코디네이터의 이름이 입력되었습니다.
다시 말하지만, 분기 논리를 사용하면 사례에 필요한 만큼의 샘플을 수집할 수 있습니다. 이 경우, 두 개의 샘플이 수집되었으며, 유리체 코어 및 전방 챔버 유체 샘플처럼 보입니다. 각 샘플의 바코드를 여기에서 스캔하여 양식에 기록했습니다.
마지막으로, 코디네이터가 채취한 유체의 양과 품질을 포함한 관련 세부 정보를 입력할 수 있는 샘플 수집 메모 섹션이 있습니다. 이 최종 파일 업로드 섹션에서는 관련 사진, 비디오 또는 문서를 양식 자체에 업로드하고 연결할 수 있습니다. 마지막으로, 모든 것이 완료되면 코디네이터는 다음 제출을 클릭할 수 있으며 양식은 모든 관련 정보가 저장된 상태로 저장되어 샘플과 환자를 성공적으로 연결합니다.
드라이아이스에 담긴 샘플을 수술실에서 실험실로 운반합니다. 랩 컴퓨터에서 REDCap에 로그인합니다. 수집된 샘플 중 하나를 가져와 바코드를 데이터베이스로 스캔합니다.
이제 드라이아이스가 담긴 두 번째 용기와 극저온 바이알용 랙이 필요합니다. 랙의 바코드도 데이터베이스로 스캔되고 샘플이 랙으로 전송됩니다. 랙에 있는 바이알의 위치가 데이터베이스에 추가되고 항목이 저장되고 닫힙니다.
그런 다음 바이알이 있는 랙을 드라이아이스에 담아 냉장고로 운반하여 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 랙은 좌표계를 사용하여 냉장고의 특정 위치에 추가됩니다. 이렇게 하면 나중에 다운스트림 분석을 위해 샘플을 쉽게 검색할 수 있습니다.
이 비디오는 샘플 스토리지 양식에 대한 연습입니다. 여기에서 환자 개요 기록을 볼 수 있습니다. 이 녹색 원은 샘플 수집 항목 양식이 이미 완료되었음을 나타냅니다.
이 빈 원은 저장 양식을 작성해야 함을 나타냅니다. 입력 양식 단계에서 수집된 각 샘플에 대해 저장 양식을 작성해야 합니다. 이 원을 클릭하면 첫 번째 샘플 저장 양식으로 이동합니다.
여기서 PID가 생성되고 MRN이 마스킹되었음을 알 수 있습니다. 해당 정보는 여전히 액세스할 수 있으며 입력 양식의 녹색 원을 클릭하여 이전 페이지를 사용하여 액세스할 수 있습니다. 여기에서 이 페이지가 완료되면 표본 스냅샷이 생성됩니다.
컬렉션 메모 아래에는 입력 양식에서 정보를 자동으로 가져온 것을 볼 수 있습니다. 다음으로 기록 보관 날짜 아래에 이 양식이 완성되는 날짜를 입력할 수 있습니다. 표본 튜브 바코드 아래에 보관 중인 튜브의 바코드를 스캔하거나 다시 입력합니다.
이 표본 스냅샷은 실시간으로 업데이트되고 있습니다. 이 섹션에서는 샘플이 전송되는지 여부를 선택할 수 있습니다. 여기에 관련 정보를 입력합니다.
이 예를 위해 우리는 이것이 내부 생물 저장소 저장소로 들어가는 샘플임을 나타낼 것입니다. 검증을 통해 연구 코디네이터는 돌아가서 전자 동의 또는 서면 동의가 프로토콜 내에서 성공적으로 완료되었는지 확인할 수 있습니다. 이 확인을 완료한 사람의 이름이 입력되고 이 드롭다운을 사용하여 검증기가 여기에 있는 바코드를 방금 입력한 내용과 일치시킵니다.
이렇게 하면 정확성이 보장됩니다. 다음으로 이 위치 단계에서 샘플을 저장할 냉동고를 볼 수 있습니다. 샘플을 보관할 선반을 표시하고 스캔하거나 입력할 수 있는 상자 바코드를 기록할 수 있습니다.
여기에 상자 레이블을 입력할 수도 있으며 추가 일치를 위해 상자에 레이블을 배치할 수 있습니다. 그런 다음 행과 열의 두 위치가 모두 기록됩니다. 이렇게 하면 모든 바코드가 나중에 쉽게 검색할 수 있도록 기록되는 상자 내의 위치와 연결됩니다.
이 사용법 섹션에서 프로젝트 이름을 입력하거나 드롭다운 상자에서 하나를 선택할 수 있습니다. 표본 부피를 기록합니다. 그리고 여기에서 날짜와 시간, 그리고 이 양식에 마지막으로 액세스한 사용자가 자동으로 채워져 필요에 따라 검토하고 감사할 수 있는 관리 체인을 보장합니다.
양식을 보관하는 사람은 여기에 자신의 이름을 입력하고 저장을 위해 이 입력 양식 내에 기록하려는 내용과 일치할 수 있는 관련 메모를 여기에 표시합니다. 마지막으로 파일을 업로드하는 또 다른 섹션이 있으며 이 모든 작업이 완료되면 저장 및 종료를 클릭하여 이 양식을 작성하고 제출할 수 있으며 환자 개요로 돌아갑니다. 작성해야 하는 각 추가 양식, 저장해야 하는 모든 튜브에 대해 이 더하기 버튼을 클릭하여 샘플 저장 양식으로 돌아가 다른 레코드를 생성할 수 있습니다.
이 개요는 생성된 입력 양식과 이 환자 기록에 대한 후속 저장 양식에 대한 액세스를 제공합니다. 이러한 방식으로 REDCap 내에서 백엔드 액세스 또는 기타 주어진 권한이 있는 모든 사람이 쉽게 검색하고 액세스할 수 있습니다. 수집된 액체 생검은 단백질체학, 글리코믹스 및 대사체학을 포함한 다양한 분자 분석을 받을 수 있습니다.
REDCap 데이터베이스를 사용하면 예를 들어 특정 질병을 앓고 있는 환자의 샘플을 검색하여 샘플을 간단하고 빠르게 검색할 수 있습니다. 이것은 면역력이 저하되고 망막 및 시신경 염증을 보인 17세 여성 환자의 경우입니다. 감염을 우려하여 방수액 생검을 시행하고 DNA PCR 분석을 위해 보냈습니다.
결과는 CMV에 대해 양성이고 HSV 및 톡소플라스마증에 대해 음성이었으며 감염성 형태의 안구 내 염증과 비감염성 형태의 안구 내 염증을 구별하고 적절한 치료법을 선택하는 데 중요했습니다. 액체 크로마토그래피 질량분석법은 프로테옴의 편향되지 않은 반정량적 분석을 가능하게 합니다. 유리체 절제술을 받는 환자의 유리체에서 채취한 액체 생검에서 이 기술은 보체 C3, 옵티신 및 콜라겐 유형 2를 포함한 484개의 고유한 단백질을 식별할 수 있었습니다.
3개의 유리체 액체 생검을 glycoproteomics multiplex 분석기를 사용하여 분석했습니다. 이 분석은 500개의 인간 단백질의 당화 프로파일을 검출하여 대사, 면역 반응, 세포 부착 및 액틴 조직과 같은 다양한 생물학적 경로를 포착했습니다. 우리는 또한 특별한 형태의 질량 분석법을 사용하여 수액 액체 생검의 대사체학 프로필을 분석했습니다.
우리는 3개의 수성 인간 액체 생검에서 292개의 서로 다른 대사 산물을 확인했습니다. 경로 분석을 통해 아미노산 대사, 요화물 주기 및 카르니틴 합성을 포함한 다양한 대사 경로가 확인되었습니다. 결론적으로, 우리의 워크플로는 수술실과 연구실 사이에 실용적인 인터페이스를 구축하여 고품질 수술 표본의 표준화되고 높은 처리량의 수집, 주석 및 보관을 가능하게 했습니다.
샘플은 단백질체학, 글리코믹스 및 대사체학 연구를 포함한 분자 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다. 당사의 프로토콜은 향후 중개 연구를 위한 귀중한 토대를 제공합니다.
