Молекулярное профилирование жидких биопсий из человеческого глаза может захватывать локально обогащенные жидкости, содержащие тысячи различных молекул из узкоспециализированных тканей глаза. Они позволяют молекулярную характеристику глазных заболеваний у живых людей и дальнейший потенциал для определения новых диагностических и терапевтических стратегий. Здесь мы разработали протокол стандартизированного сбора и биобанкирования высококачественной биопсии водянистой влаги и стекловидного тела во время внутриглазной хирургии.
Частью протокола является веб-база данных, соответствующая конфиденциальности данных, для аннотирования каждого образца в течение его жизненного цикла и использование системы координат, которая позволяет отслеживать местоположение каждого образца со штрих-кодом в хранилище, что обеспечивает эффективный поиск образцов для последующих экспериментов, таких как анализ белка, гликана и метаболита. Используйте операционный микроскоп для выполнения парацентеза передней камеры перпендикулярно лимбу с помощью иглы от 30 до 32 калибра, соединенной со шприцем объемом в один мл. Ватный наконечник можно использовать для стабилизации глаза во время этой процедуры.
Убедитесь, что кончик иглы остается над периферической радужной оболочкой в средней передней камере, чтобы избежать повреждения внутриглазных структур. При прямой визуализации с помощью микроскопа вручную аспирируйте примерно сто микролитров неразбавленной водянистой влаги с помощью шприца объемом один мл. Затем иглу осторожно извлекают из передней камеры.
В факичном глазу держите иглу над радужной оболочкой, чтобы не касаться хрусталика. Положительное давление на земной шар может увеличить рефлюкс. Освобождение кончика ваты до того, как игла будет извлечена, помогает уменьшить рефлюкс.
Отведите сантехника назад и посмотрите, как движется воздух и собранная жидкость. Введите шприц в криофлакон. Дополнительный воздух очищает мертвое пространство шприца.
Здесь вы можете увидеть штрих-код, который навсегда выгравирован на флаконе. Затем штрих-код используется для сканирования образца в форму REDCap на компьютере в операционной. Криофлакон будет немедленно перенесен на сухой лед в холодильную камеру.
Биопсия стекловидного тела может быть получена в начале витрэктомии обученным витреоретинальным хирургом. Обратите внимание, что резак для витрэктомии не будет заправлен жидкостью. В полости стекловидного тела активируйте стекловидный резец без инфузии, чтобы собрать неразбавленный образец стекловидного тела.
Вручную аспирируют от 0,5 до одного мл стекловидного тела с помощью шприца, который соединен с канюлей для экструзии стекловидного тела. Затем образец обрабатывается, как мы продемонстрировали, для получения точного образца плечевой кости. Это видео представляет собой пошаговое руководство по заполненной форме сбора образцов в REDCap в представлении опроса.
После того, как пациент заполняет электронное согласие с помощью координатора клинических исследований, эта форма заполняется. Доступ к нему можно получить на том же устройстве, на которое пациент получил электронное согласие, или с любого другого утвержденного устройства. Копию заполненного электронного согласия можно найти здесь для проверки подписей.
Затем координатор заполняет другие соответствующие разделы, включая тип согласия, и в этом синем разделе подробную информацию о самом случае, такую как хирург, где он был выполнен, дату сбора и другую соответствующую информацию. В следующем зеленом разделе для пациентов у нас есть демографические данные пациентов, включая образец MRN, имя и фамилию пациента, его пол, дату рождения с автоматическим расчетом возраста, латеральность пораженного глаза и диагностическую категорию. Эта форма имеет логику ветвления, поэтому, когда флажок установлен, он влияет на внешний вид флажков под ним.
В данном случае это передний отрезок и корпус сетчатки. Итак, сначала заполняется диагностический ящик сетчатки. Координатор выбрал, что это макулярное отверстие, и поле для диагностики переднего сегмента также было заполнено.
В этом случае похоже, что это катаракта. Форма истории перед операцией также заполняется в виде свободного текстового поля. Здесь информация из EMR может быть скопирована и вставлена или новая информация о предоперационной истории может быть введена для дальнейшего использования.
Далее, в этом красном разделе, у нас есть окно процедуры. В этом случае похоже, что витрэктомия pars plana была выбрана вместе с фако-ИОЛ. Все, что не заполнено здесь ни в одном из этих флажков, может быть введено произвольным текстом с помощью этих других полей, которые разбросаны по всей форме.
Соответствующие подробности о самом деле также дополняются. Наконец, в этом золотом разделе у нас есть зона сбора. Здесь было введено имя координатора, собирающего образец, а также количество используемых пробирок для образцов.
Опять же, используя логику ветвления, мы можем собрать столько образцов, сколько необходимо для дела. В этом случае были собраны два образца, выглядящие как ядро стекловидного тела и образец жидкости передней камеры. Штрих-коды каждого из этих образцов были отсканированы здесь и записаны в форму.
Наконец, есть раздел заметок о сборе образцов, где координатор может ввести соответствующие данные, включая объемы и качество взятой жидкости. В этом заключительном разделе загрузки файлов любые соответствующие фотографии, видео или документацию можно загрузить в саму форму и связать их. Наконец, как только все будет завершено, координатор может нажать «Отправить далее», и форма будет сохранена со всей сохраненной соответствующей информацией, что позволит успешно связать образец с пациентом.
Транспортируйте образцы на сухом льду из операционной в лабораторию. Войдите в REDCap на компьютере лаборатории. Возьмите один из собранных образцов и отсканируйте штрих-код в базу данных.
Теперь нужен второй контейнер с сухим льдом и стеллаж для криофлаконов. Штрих-код стойки также будет отсканирован в базу данных, а образцы будут перенесены на стойку. Положение флаконов в стойке добавляется в базу данных, а запись сохраняется и закрывается.
Затем стеллаж с флаконами транспортируется на сухом льду в холодильник для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Стеллаж добавляется в определенное положение в холодильнике с помощью системы координат. В дальнейшем это позволит легко извлекать образцы для последующего анализа.
Это видео представляет собой пошаговое руководство по образцу формы хранения. Здесь мы видим обзорную запись пациента. Этот зеленый кружок указывает на то, что форма ввода для сбора образцов уже заполнена.
Этот пустой кружок указывает на то, что необходимо заполнить форму хранения. Форма хранения должна быть заполнена для каждого образца, собранного на этапе заполнения формы заявки. Щелкнув по этому кругу, мы попадем в первую форму хранения образцов.
Здесь мы видим, что был сгенерирован PID и MRN был замаскирован. Эта информация по-прежнему доступна, и к ней можно получить доступ на предыдущей странице, щелкнув зеленый кружок в форме заявки. Здесь снимок образца будет сгенерирован после завершения этой страницы.
В примечаниях к сбору мы видим, что информация была автоматически импортирована из формы ввода. Затем, в разделе «Архивная дата записи», мы можем ввести дату заполнения этой формы. Под штрих-кодом пробирки образца мы сканируем или повторно вводим штрих-код трубки, которая архивируется.
В режиме реального времени этот снимок образца обновляется. В этом разделе мы можем выбрать, будет ли переноситься образец. Здесь мы вводим соответствующую информацию.
В этом примере мы укажем, что это образец, идущий во внутреннее хранилище биорепозитория. При проверке координатор исследования может вернуться и убедиться, что электронное согласие или бумажное согласие было заполнено успешно и в соответствии с протоколами. Вводится имя человека, выполняющего эту проверку, и с помощью этого выпадающего списка верификатор сопоставляет штрих-код с тем, что было только что введено.
Это обеспечивает точность. Затем, на этом этапе размещения, мы видим морозильную камеру, в которой будет храниться образец. Мы можем указать полку, на которой будет храниться образец, а также записать штрих-код коробки, который можно отсканировать или напечатать.
Здесь также может быть напечатана этикетка коробки, и этикетка может быть размещена на коробке для дальнейшего сопоставления. Затем записываются две позиции по строкам и столбцам. Это гарантирует, что каждый штрих-код связан с позицией в коробке, которая записывается для легкого поиска в будущем.
В этом разделе использования мы можем ввести название нашего проекта или выбрать его из выпадающего списка. Запишите объем образца. И здесь дата и время, а также пользователь, который в последний раз обращался к этой форме, заполняются автоматически, чтобы обеспечить цепочку поставок, которую можно просматривать и проверять по мере необходимости.
Лицо, архивирующее форму, вводит здесь свое имя и указывает здесь любые соответствующие примечания, которые могут соответствовать тому, что он хочет записать в этой форме записи для хранения. Наконец, есть еще один раздел для загрузки файла, и как только все это будет завершено, эту форму можно заполнить и отправить, нажав «Сохранить и выйти», что возвращает нас к обзору пациента. Для каждой дополнительной формы, которую необходимо заполнить, для каждой пробирки, которая должна быть сохранена, мы можем нажать эту кнопку с плюсом, чтобы вернуться в форму хранения образцов и создать еще одну запись.
Этот обзор предоставляет доступ к созданной форме ввода, а также ко всем последующим формам хранения для этой карты пациента. Таким образом, его легко извлечь и получить любой, у кого есть внутренний доступ или другие заданные разрешения в REDCap. Собранные жидкие биопсии могут быть подвергнуты различным молекулярным анализам, включая протеомику, гликомику и метаболомику.
База данных REDCap позволяет легко и быстро извлекать образцы, например, путем поиска образцов от пациентов с определенным заболеванием. Речь идет о 17-летней пациентке с ослабленным иммунитетом и воспалением сетчатки и зрительного нерва. Из-за опасений по поводу инфекции была проведена жидкая биопсия водянистой влаги и отправлена на анализ ДНК ПЦР.
Результаты были положительными для ЦМВ и отрицательными для ВПГ и токсоплазмоза и имели решающее значение для различения инфекционных и неинфекционных форм внутриглазного воспаления и выбора соответствующей терапии. Жидкостная хроматография, масс-спектрометрия позволяет проводить объективный и полуколичественный анализ протеома. При жидкостной биопсии из стекловидного тела пациента, перенесшего витрэктомию, метод смог идентифицировать 484 уникальных белка, включая комплемент С3, оптицин и коллаген 2-го типа.
Три биопсии стекловидного тела были проанализированы с использованием мультиплексного анализатора гликопротеомики. Анализ обнаружил профили гликозилирования 500 белков человека, захватывая различные биологические пути, такие как метаболизм, иммунный ответ, клеточная адгезия и организация актина. Мы также проанализировали метаболомный профиль биопсии жидкой жидкости водянистой влаги с использованием специальной формы масс-спектрометрии.
Мы идентифицировали 292 различных метаболита в трех водных жидких биопсиях человека. Анализ путей выявил различные метаболические пути, включая метаболизм аминокислот, цикл мочеиспускания и синтез карнитина. В заключение, наш рабочий процесс установил практический интерфейс между операционной и исследовательской лабораторией, который позволяет стандартизированно и высокопроизводительно собирать, аннотировать и хранить высококачественные хирургические образцы.
Образцы могут быть использованы для последующего молекулярного анализа, включая протеомику, гликомику и метаболомные исследования. Наш протокол обеспечивает ценную основу для будущих трансляционных исследований.
