La profilazione molecolare delle biopsie liquide dall'occhio umano può catturare fluidi arricchiti localmente contenenti migliaia di molecole diverse da tessuti oculari altamente specializzati. Consentono la caratterizzazione molecolare delle malattie oculari nell'uomo vivente e di ulteriori potenziali per identificare nuove strategie diagnostiche e terapeutiche. Qui abbiamo sviluppato un protocollo per la raccolta standardizzata e la biobanca di umori acquei di alta qualità e biopsie liquide vitreali durante la chirurgia intraoculare.
Parte del protocollo è un database basato sul web conforme alla privacy dei dati per annotare ogni campione nel corso della sua vita e l'uso di un sistema di coordinate che consente di tracciare la posizione di ciascun campione con codice a barre in deposito, che consente un recupero efficiente del campione per esperimenti a valle come l'analisi di proteine, glicani e metaboliti. Utilizzare un microscopio operatorio per eseguire una paracentesi della camera anteriore perpendicolare al limbus utilizzando un ago da 30 a 32 gauge collegato a una siringa da un ml. Una punta di cotone può essere utilizzata per stabilizzare l'occhio durante questa procedura.
Assicurarsi che la punta dell'ago rimanga sopra l'iride periferica nella camera anteriore media per evitare danni alle strutture intraoculari. Sotto visualizzazione diretta al microscopio, aspirare manualmente circa un centinaio di microlitri di umore acqueo non diluito usando una siringa da un ml. L'ago viene quindi accuratamente rimosso dalla camera anteriore.
In un occhio fachico, tenere l'ago sopra l'iride per evitare di toccare la lente. La pressione positiva sul globo può aumentare il reflusso. Rilasciare la punta di cotone prima che l'ago venga estratto aiuta a ridurre il reflusso.
Tira indietro l'idraulico e guarda come si muove l'aria e il fluido raccolto. Iniettare la siringa nel flaconcino di crio. L'aria extra libera lo spazio morto della siringa.
Qui puoi vedere il codice a barre che è inciso in modo permanente sulla fiala. Il codice a barre viene quindi utilizzato per scansionare il campione nel modulo REDCap su un computer in sala operatoria. Il flaconcino criogenico verrà immediatamente trasferito su ghiaccio secco nella scatola di raffreddamento.
Le biopsie liquide vitreali possono essere ottenute all'inizio di una vitrectomia da un chirurgo vitreoretinico addestrato. Si noti che il cutter per vitrectomia non sarà innescato con liquido. Nella cavità vitreale, attivare la fresa vitreale senza infusione per raccogliere un campione vitreo non diluito.
Aspirare manualmente da 0,5 a un ml di vitreo utilizzando una siringa collegata alla cannula di estrusione vitreale. Il campione viene quindi elaborato come abbiamo dimostrato per un campione omerale accurato. Questo video è una procedura dettagliata di un modulo di raccolta di esempi compilato in REDCap nella visualizzazione sondaggio.
Una volta che un paziente completa il consenso elettronico con l'assistenza di un coordinatore della ricerca clinica, questo modulo viene compilato. È possibile accedervi dallo stesso dispositivo su cui il paziente ha ottenuto il consenso elettronico oppure è possibile accedervi utilizzando qualsiasi altro dispositivo approvato. Una copia del consenso elettronico che è stato completato è accessibile qui per verificare le firme.
Il coordinatore compila quindi le altre sezioni pertinenti, incluso il tipo di consenso e in questa sezione blu, i dettagli sul caso stesso, come il caso chirurgo, dove è stato eseguito, la data della raccolta e altre informazioni pertinenti. In questa prossima sezione verde del paziente, abbiamo dati demografici del paziente, tra cui un campione MRN, il nome e il cognome del paziente, il sesso, la data di nascita con un calcolo automatico dell'età, la lateralità dell'occhio interessato e la categoria diagnostica. Questo modulo presenta una logica di diramazione, pertanto quando viene selezionata una casella di controllo influisce sull'aspetto delle caselle di controllo sottostanti.
In questo caso, questo è un segmento anteriore e un caso di retina. Quindi, per prima cosa, la scatola della retina di diagnosi è popolata. Il coordinatore ha selezionato che si tratta di un foro maculare ed è stata popolata anche la casella di diagnosi del segmento anteriore.
In questo caso, sembra che sia una cataratta. Un modulo di cronologia pre-operazione viene anche popolato come casella di testo libero. Qui, le informazioni dall'EMR possono essere copiate e incollate o nuove informazioni sulla cronologia pre-operatoria possono essere inserite per riferimento futuro.
Successivamente, in questa sezione rossa, abbiamo la casella della procedura. In questo caso, sembra che sia stata selezionata una vitrectomia pars plana insieme alla IOL phaco. Tutto ciò che non è popolato qui in nessuna di queste caselle di controllo può essere immesso in testo libero utilizzando queste altre caselle che sono disseminate in tutto il modulo.
Vengono inoltre completati i dettagli rilevanti sul caso stesso. Infine, in questa sezione d'oro, abbiamo un'area di raccolta. Il nome del coordinatore che raccoglie il campione e il numero di provette utilizzate sono stati inseriti qui.
Ancora una volta, utilizzando la logica di ramificazione, siamo in grado di raccogliere tutti i campioni necessari per il caso. In questo caso, sono stati raccolti due campioni, sembra un nucleo vitreo e un campione di fluido della camera anteriore. I codici a barre di ciascuno di questi campioni sono stati scansionati qui e registrati nel modulo.
Infine, c'è una sezione di note di raccolta di campioni in cui il coordinatore può digitare i dettagli pertinenti, inclusi i volumi e la qualità del fluido prelevato. In questa sezione finale di caricamento dei file, tutte le foto, i video o la documentazione rilevanti possono essere caricati nel modulo stesso e collegati. Infine, una volta completato tutto, il coordinatore può fare clic su invia avanti e il modulo viene salvato con tutte le informazioni rilevanti memorizzate, collegando correttamente il campione con il paziente.
Trasportare i campioni su ghiaccio secco dalla sala operatoria al laboratorio. Accedere a REDCap sul computer di laboratorio. Prendi uno dei campioni raccolti e scansiona il codice a barre nel database.
Ora è necessario un secondo contenitore con ghiaccio secco e un rack per le fiale criogeniche. Anche il codice a barre del rack verrà scansionato nel database e i campioni verranno trasferiti nel rack. La posizione delle fiale nel rack viene aggiunta al database e la voce viene salvata e chiusa.
Il rack con le fiale viene quindi trasportato su ghiaccio secco al frigorifero per la conservazione a meno 80 gradi Celsius. Il rack viene aggiunto a una posizione specifica nel frigorifero utilizzando un sistema di coordinate. Ciò consentirà in seguito di recuperare facilmente i campioni per l'analisi a valle.
Questo video è una procedura dettagliata del modulo di archiviazione di esempio. Qui, vediamo il record di panoramica del paziente. Questo cerchio verde indica che il modulo di inserimento della raccolta di campioni è già stato completato.
Questo cerchio vuoto indica che un modulo di archiviazione deve essere completato. Un modulo di conservazione deve essere compilato per ogni campione raccolto durante la fase del modulo di iscrizione. Facendo clic su questo cerchio si accede al primo modulo di archiviazione di esempio.
Qui possiamo vedere che è stato generato un PID e l'MRN è stato mascherato. Tali informazioni sono ancora accessibili e sono accessibili utilizzando la pagina precedente facendo clic sul cerchio verde nel modulo di iscrizione. Qui verrà generata un'istantanea del campione una volta completata questa pagina.
Sotto le note di raccolta, vediamo che le informazioni sono state importate automaticamente dal modulo di iscrizione. Successivamente, in Data di archiviazione record, possiamo inserire la data in cui questo modulo è in fase di completamento. Sotto il codice a barre del tubo campione, eseguiamo la scansione o reinseriamo il codice a barre del tubo che viene archiviato.
In tempo reale, questa istantanea del campione viene aggiornata. In questa sezione, è possibile selezionare se un campione viene trasferito. Qui inseriamo queste informazioni rilevanti.
Per il bene di questo esempio, indicheremo che questo è un campione che va nella memoria interna del biorepository. In fase di verifica, un coordinatore di ricerca può tornare indietro e verificare che il consenso elettronico o cartaceo sia stato completato correttamente e all'interno dei protocolli. Viene inserito il nome della persona che completa questa verifica e utilizzando questo menu a discesa, il verificatore abbina il codice a barre qui con quello appena digitato.
Ciò garantisce la precisione. Successivamente, in questa fase di localizzazione, vediamo il congelatore in cui verrà conservato il campione. Possiamo indicare lo scaffale in cui verrà conservato il campione e registrare il codice a barre della scatola, che può essere scansionato o digitato.
Un'etichetta della scatola può anche essere digitata qui e l'etichetta può essere posizionata sulla scatola per un'ulteriore corrispondenza. Quindi le due posizioni per riga e colonna vengono entrambe registrate. Ciò garantisce che ogni codice a barre sia associato a una posizione all'interno della scatola che viene registrata per un facile recupero in futuro.
In questa sezione di utilizzo, possiamo inserire il nome del nostro progetto o selezionarne uno da una casella a discesa. Registrare il volume del campione. E qui, la data e l'ora, nonché l'ultimo utente che ha effettuato l'accesso a questo modulo vengono compilati automaticamente per garantire una catena di custodia che può essere rivista e verificata secondo necessità.
La persona che archivia il modulo inserisce qui il proprio nome e indica qui eventuali note pertinenti che potrebbero essere coerenti con ciò che desidera registrare all'interno di questo modulo di registrazione per la conservazione. Infine, c'è un'altra sezione per caricare un file e, una volta completato tutto questo, questo modulo può essere completato e inviato facendo clic su salva ed esci, il che ci riporta alla panoramica del paziente. Per ogni modulo aggiuntivo che deve essere completato, per ogni tubo che deve essere memorizzato, possiamo fare clic su questo pulsante più per tornare al modulo di archiviazione del campione e generare un altro record.
Questa panoramica fornisce un accesso al modulo di iscrizione che è stato generato, nonché a tutti i moduli di archiviazione successivi per questa cartella del paziente. In questo modo, è facilmente recuperabile e accessibile da chiunque abbia accesso backend o altre autorizzazioni all'interno di un REDCap. Le biopsie liquide raccolte possono essere sottoposte a una varietà di analisi molecolari tra cui proteomica, glicomica e metabolomica.
Il database REDCap consente un recupero semplice e rapido dei campioni, ad esempio cercando campioni di pazienti con una malattia specifica. Questo è un caso di una paziente di 17 anni che era immunocompromessa e che presentava infiammazione della retina e del nervo ottico. Essendo preoccupato per un'infezione, è stata eseguita una biopsia liquida dell'umore acqueo e inviata per l'analisi PCR del DNA.
I risultati sono stati positivi per CMV e negativi per HSV e toxoplasmosi e sono stati fondamentali per distinguere le forme infettive da quelle non infettive di infiammazione intraoculare e selezionare la terapia appropriata. La spettrometria di massa per cromatografia liquida consente un'analisi imparziale e semi-quantitativa del proteoma. In una biopsia liquida dal vitreo di un paziente sottoposto a vitrectomia, la tecnica è stata in grado di identificare 484 proteine uniche, tra cui il complemento C3, l'ottica e il collagene di tipo 2.
Tre biopsie liquide vetrose sono state analizzate utilizzando un analizzatore multiplex glicoproteomica. Il test ha rilevato i profili di glicosilazione di 500 proteine umane, catturando una varietà di percorsi biologici come il metabolismo, la risposta immunitaria, l'adesione cellulare e l'organizzazione dell'actina. Abbiamo anche analizzato il profilo metabolomico delle biopsie liquide dell'umore acqueo utilizzando una speciale forma di spettrometria di massa.
Abbiamo identificato 292 diversi metaboliti in tre biopsie liquide umane acquose. Un'analisi del percorso ha identificato una varietà di percorsi metabolici tra cui il metabolismo degli aminoacidi, il ciclo dell'uria e la sintesi della carnitina. In conclusione, il nostro flusso di lavoro ha stabilito un'interfaccia pratica tra la sala operatoria e il laboratorio di ricerca che consente la raccolta, l'annotazione e la conservazione standardizzate e ad alta produttività di campioni chirurgici di alta qualità.
I campioni possono essere utilizzati per analisi molecolari a valle, tra cui studi di proteomica, glicomica e metabolomica. Il nostro protocollo fornisce una base preziosa per la futura ricerca traslazionale.
