O perfil molecular de biópsias líquidas do olho humano pode capturar fluidos localmente enriquecidos contendo milhares de moléculas diferentes de tecidos oculares altamente especializados. Eles permitem a caracterização molecular de doenças oculares em seres humanos vivos e de maior potencial para identificar novas estratégias diagnósticas e terapêuticas. Aqui desenvolvemos protocolo para coleta padronizada e biobanco de biópsias de humor aquoso e líquido vítreo de alta qualidade durante cirurgia intraocular.
Parte do protocolo é um banco de dados compatível com a privacidade de dados baseado na web para anotar cada amostra ao longo de sua vida útil e o uso de um sistema de coordenadas que permite rastrear a localização de cada amostra com código de barras em armazenamento, o que permite a recuperação eficiente de amostras para experimentos a jusante, como análise de proteínas, glicanos e metabólitos. Use um microscópio cirúrgico para realizar uma paracentese de câmara anterior perpendicular ao limbo usando uma agulha de calibre 30 a 32 conectada a uma seringa de um ml. Uma ponta de algodão pode ser usada para estabilizar o olho durante este procedimento.
Certifique-se de que a ponta da agulha permaneça sobre a íris periférica na câmara média anterior para evitar danos às estruturas intraoculares. Sob visualização direta através do microscópio, aspirar manualmente aproximadamente cem microlitros de humor aquoso não diluído usando uma seringa de um ml. A agulha é então cuidadosamente removida da câmara anterior.
Em um olho fácico, mantenha a agulha sobre a íris para evitar tocar na lente. A pressão positiva sobre o globo ocular pode aumentar o refluxo. Soltar a ponta do algodão antes que a agulha seja retirada ajuda a reduzir o refluxo.
Puxe o encanador para trás e veja como o ar e o fluido coletado estão se movendo. Injete a seringa no frasco para injetáveis de crio. O ar extra limpa o espaço morto da seringa.
Aqui você pode ver o código de barras que está gravado permanentemente no frasco. O código de barras é então usado para digitalizar a amostra para o formulário REDCap em um computador na sala de cirurgia. O frasco para injetáveis de crio será imediatamente transferido para gelo seco na caixa de arrefecimento.
Biópsias vítreas líquidas podem ser obtidas no início de uma vitrectomia por um cirurgião vitreorretiniano treinado. Observe que o cortador de vitrectomia não será preparado com líquido. Na cavidade vítrea, ative o cortador vítreo sem infusão para coletar uma amostra vítrea não diluída.
Aspirar manualmente 0,5 a um ml de vítreo com uma seringa conectada à cânula de extrusão vítrea. A amostra é então processada como demonstramos para um espécime umeral preciso. Este vídeo é um passo a passo de um formulário de coleta de amostra preenchido em REDCap no modo de exibição de pesquisa.
Uma vez que um paciente preenche o consentimento eletrônico com a assistência de um coordenador de pesquisa clínica, este formulário é preenchido. Ele pode ser acessado no mesmo dispositivo em que o paciente foi consentido eletronicamente, ou pode ser acessado usando qualquer outro dispositivo aprovado. Uma cópia do consentimento eletrônico que foi preenchido pode ser acessada aqui para que as assinaturas sejam verificadas.
O coordenador então preenche as outras seções relevantes, incluindo o tipo de consentimento e, nesta seção azul, detalhes sobre o caso em si, como o cirurgião do caso, onde foi realizado, a data da coleta e outras informações relevantes. Nesta próxima seção verde do paciente, temos os dados demográficos do paciente, incluindo uma amostra de NMR, o nome e sobrenome do paciente, seu sexo, data de nascimento com um autocálculo da idade, a lateralidade do olho afetado e categoria diagnóstica. Esse formulário apresenta lógica de ramificação, portanto, quando uma caixa de seleção é marcada, ela afeta a aparência das caixas de seleção abaixo dela.
Neste caso, trata-se de um caso de segmento anterior e retina. Então, primeiro, a caixa de retina de diagnóstico é preenchida. O coordenador selecionou que se trata de um buraco macular e a caixa de diagnóstico do segmento anterior também foi preenchida.
Neste caso, parece que é uma catarata. Um formulário de histórico pré-operatório também é preenchido como uma caixa de texto livre. Aqui, as informações do EMR podem ser copiadas e coladas ou novas informações sobre o histórico pré-operatório podem ser inseridas para referência futura.
Em seguida, nesta seção vermelha, temos a caixa de procedimento. Neste caso, parece que uma vitrectomia pars plana foi selecionada juntamente com a lente intraocular de um facico. Qualquer coisa não preenchida aqui em qualquer uma dessas caixas de seleção pode ser inserida em texto livre usando essas outras caixas que são salpicadas em todo o formulário.
Detalhes relevantes sobre o caso em si também são concluídos. Finalmente, nesta seção de ouro, temos uma área de coleta. O nome do coordenador que recolhe o espécime, juntamente com o número de tubos de amostra que estão a ser utilizados, foram introduzidos aqui.
Novamente, usando a lógica de ramificação, podemos coletar quantas amostras forem necessárias para o caso. Neste caso, foram coletadas duas amostras, semelhante a um núcleo vítreo e uma amostra de fluido de câmara anterior. Os códigos de barras de cada uma dessas amostras foram escaneados aqui e registrados no formulário.
Finalmente, há uma seção de notas de coleta de amostras onde o coordenador pode digitar detalhes relevantes, incluindo volumes e qualidade do fluido extraído. Nesta seção final de upload de arquivos, quaisquer fotos, vídeos ou documentação relevantes podem ser carregados no próprio formulário e vinculados. Finalmente, uma vez que tudo esteja concluído, o coordenador pode clicar em enviar em seguida e o formulário é salvo com todas as informações relevantes armazenadas, conectando a amostra com sucesso com o paciente.
Transporte as amostras em gelo seco da sala de cirurgia para o laboratório. Faça login no REDCap no computador do laboratório. Pegue uma das amostras coletadas e digitalize o código de barras no banco de dados.
Agora, um segundo recipiente com gelo seco e um rack para os frascos de crio é necessário. O código de barras do rack também será digitalizado para o banco de dados e as amostras serão transferidas para o rack. A posição dos frascos no rack é adicionada ao banco de dados e a entrada é salva e fechada.
O rack com os frascos para injetáveis é então transportado em gelo seco para o frigorífico para armazenamento a menos 80 graus Celsius. O rack é adicionado a uma posição específica na geladeira usando um sistema de coordenadas. Isso permitirá mais tarde recuperar facilmente amostras para análise a jusante.
Este vídeo é um passo a passo do formulário de armazenamento de exemplo. Aqui, vemos o registro de visão geral do paciente. Esse círculo verde indica que o formulário de entrada da coleta de amostra já foi preenchido.
Esse círculo vazio indica que um formulário de armazenamento deve ser preenchido. Um formulário de armazenamento deve ser preenchido para cada amostra coletada durante a fase de formulário de entrada. Clicar neste círculo nos levará ao primeiro formulário de armazenamento de amostra.
Aqui podemos ver que uma IDP foi gerada e a MRN foi mascarada. Essas informações ainda estão acessíveis e podem ser acessadas usando a página anterior, clicando no círculo verde no formulário de entrada. Aqui, um instantâneo de amostra será gerado assim que esta página for concluída.
Em notas de coleta, vemos que as informações foram importadas automaticamente do formulário de entrada. Em seguida, em data de arquivamento do registro, podemos inserir a data em que este formulário está sendo preenchido. Sob o código de barras do tubo da amostra, digitalizamos ou reinserimos o código de barras do tubo que está sendo arquivado.
Em tempo real, este instantâneo do espécime está sendo atualizado. Nesta seção, podemos selecionar se uma amostra está sendo transferida para fora. Aqui inserimos essa informação relevante.
Para fins deste exemplo, vamos indicar que esta é uma amostra que vai para o armazenamento interno do biorrepositório. Sob verificação, um coordenador de pesquisa pode voltar e verificar se o consentimento eletrônico ou em papel foi concluído com sucesso e dentro dos protocolos. O nome da pessoa que está concluindo essa verificação é inserido e, usando essa lista suspensa, o verificador combina o código de barras aqui com o que acabou de ser digitado.
Isso garante precisão. Em seguida, nesta fase de localização, vemos o freezer onde a amostra será armazenada. Podemos indicar a prateleira onde a amostra será armazenada, bem como registrar o código de barras da caixa, que pode ser digitalizado ou digitado.
Uma etiqueta de caixa também pode ser digitada aqui e a etiqueta pode ser colocada na caixa para correspondência adicional. Em seguida, as duas posições por linha e coluna são gravadas. Isso garante que cada código de barras seja associado a uma posição dentro da caixa que é gravada para fácil recuperação no futuro.
Nesta seção de uso, podemos inserir o nome do nosso projeto ou selecionar um em uma caixa suspensa. Registre o volume do espécime. E aqui, a data e hora, bem como o usuário que acessou este formulário pela última vez é preenchido automaticamente para garantir uma cadeia de custódia que pode ser revisada e auditada conforme necessário.
A pessoa que arquiva o formulário insere seu nome aqui e indica quaisquer anotações relevantes aqui que possam ser consistentes com o que deseja registrar neste formulário de entrada para armazenamento. Finalmente, há outra seção para carregar um arquivo e, uma vez que tudo isso seja preenchido, este formulário pode ser preenchido e enviado clicando em salvar e sair, o que nos leva de volta à visão geral do paciente. Para cada formulário adicional que deve ser preenchido, para cada tubo que deve ser armazenado, podemos clicar neste botão de adição para voltar ao formulário de armazenamento de amostra e gerar outro registro.
Esta visão geral fornece um acesso ao formulário de entrada que foi gerado, bem como quaisquer formulários de armazenamento subsequentes para esse registro de paciente. Dessa forma, ele é facilmente recuperável e acessível por qualquer pessoa com acesso de back-end ou outras permissões dadas dentro de um REDCap. As biópsias líquidas coletadas podem ser submetidas a uma variedade de análises moleculares, incluindo proteômica, glicômica e metabolômica.
O banco de dados REDCap permite a recuperação simples e rápida de amostras, por exemplo, por meio da busca de amostras de pacientes com uma doença específica. Trata-se do caso de uma paciente de 17 anos, imunocomprometida, que apresentou inflamação retiniana e do nervo óptico. Com a preocupação de uma infecção, uma biópsia líquida de humor aquoso foi realizada e enviada para análise de DNA PCR.
Os resultados foram positivos para CMV e negativos para HSV e toxoplasmose e foram críticos para distinguir formas infecciosas de não infecciosas de inflamação intraocular e selecionar a terapia apropriada. A espectrometria de massas por cromatografia líquida permite uma análise semiquantitativa e imparcial do proteoma. Em uma biópsia líquida do vítreo de um paciente submetido à vitrectomia, a técnica foi capaz de identificar 484 proteínas únicas, incluindo complemento C3, óptica e colágeno tipo 2.
Três biópsias vítreas líquidas foram analisadas usando um analisador multiplex glicoproteômico. O ensaio detectou os perfis de glicosilação de 500 proteínas humanas, capturando uma variedade de vias biológicas, como metabolismo, resposta imune, adesão celular e organização da actina. Nós também analisamos o perfil metabolômico de biópsias líquidas de humor aquoso usando uma forma especial de espectrometria de massa.
Identificamos 292 metabólitos diferentes em três biópsias líquidas humanas aquosas. Uma análise de vias identificou uma variedade de vias metabólicas, incluindo metabolismo de aminoácidos, ciclo da úria e síntese de carnitina. Em conclusão, nosso fluxo de trabalho estabeleceu uma interface prática entre o centro cirúrgico e o laboratório de pesquisa que permite coleta, anotação e armazenamento padronizados e de alto rendimento de peças cirúrgicas de alta qualidade.
As amostras podem ser usadas para análise molecular a jusante, incluindo estudos proteômicos, glicômicos e metabolômicos. Nosso protocolo fornece uma base valiosa para futuras pesquisas translacionais.
