פרופיל מולקולרי של ביופסיות נוזליות מהעין האנושית יכול ללכוד נוזלים מועשרים מקומית המכילים אלפי מולקולות שונות מרקמות עיניים מיוחדות מאוד. הם מאפשרים אפיון מולקולרי של מחלות עיניים בבני אדם חיים ובעלי פוטנציאל נוסף לזיהוי אסטרטגיות אבחון וטיפול חדשניות. כאן פיתחנו פרוטוקול לאיסוף סטנדרטי וביו-בנקאות של הומור מימי איכותי וביופסיות נוזליות בזגוגית במהלך ניתוחים תוך עיניים.
חלק מהפרוטוקול הוא מסד נתונים מבוסס אינטרנט התואם לפרטיות נתונים כדי להוסיף ביאורים לכל דגימה לאורך חייה ושימוש במערכת קואורדינטות המאפשרת לעקוב אחר המיקום של כל דגימה ברקודית באחסון, המאפשרת אחזור דגימות יעיל לניסויים במורד הזרם כגון ניתוח חלבונים, גליקן ומטבוליטים. השתמש במיקרוסקופ הפעלה כדי לבצע paracentesis החדר הקדמי בניצב ללימבוס באמצעות מחט 30 עד 32 מד מחובר מזרק אחד מ"ל. קצה צמר גפן יכול לשמש כדי לייצב את העין במהלך הליך זה.
ודא כי קצה המחט נשאר מעל הקשתית ההיקפית בחדר הקדמי האמצעי כדי למנוע נזק למבנים תוך עיניים. תחת הדמיה ישירה באמצעות המיקרוסקופ, לשאוף ידנית כמאה מיקרוליטר של הומור מימי לא מדולל באמצעות מזרק אחד מ"ל. לאחר מכן המחט מוסרת בזהירות מהחדר הקדמי.
בעין פאקית, שמור את המחט מעל הקשתית כדי למנוע נגיעה בעדשה. לחץ חיובי על כדור הארץ יכול להגביר ריפלוקס. שחרור קצה הכותנה לפני משיכת המחט עוזר להפחית ריפלוקס.
משכו את האינסטלטור לאחור וראו כיצד האוויר והנוזל שנאסף נעים. הזריקו את המזרק לבקבוקון הקריו. האוויר הנוסף מפנה את החלל המת של המזרק.
כאן תוכלו לראות את הברקוד אשר חרוט לצמיתות על הבקבוקון. לאחר מכן הברקוד משמש לסריקת הדגימה לטופס REDCap במחשב בחדר הניתוח. בקבוקון הקריו יועבר מיד על קרח יבש בקופסת הקירור.
ביופסיות נוזליות זגוגיות ניתן להשיג בתחילת ויטרקטומיה על ידי מנתח זגוגית מיומן. שים לב כי חותך vitrectomy לא יהיה מוכן עם נוזל. בחלל הזגוגית, הפעל את חותך הזגוגית ללא עירוי כדי לאסוף דגימת זגוגית לא מדוללת.
שאפו ידנית 0.5 עד מ"ל אחד של זגוגית באמצעות מזרק המחובר לצינורית האקסטרוזיה הזגוגית. לאחר מכן הדגימה מעובדת כפי שהדגמנו עבור דגימה הומרלית מדויקת. סרטון וידאו זה הוא הדרכה של טופס איסוף דגימות מלא ב- REDCap בתצוגת סקר.
לאחר שהמטופל משלים את ההסכמה האלקטרונית בסיוע מתאם מחקר קליני, טופס זה מאוכלס. ניתן לגשת אליו מאותו מכשיר שהמטופל קיבל עליו הסכמה אלקטרונית, או לגשת אליו באמצעות כל מכשיר מאושר אחר. ניתן לגשת לעותק של ההסכמה האלקטרונית שהושלמה כאן לצורך אימות חתימות.
לאחר מכן המתאם ממלא את הסעיפים הרלוונטיים האחרים כולל סוג ההסכמה ובחלק כחול זה, פרטים על המקרה עצמו, כגון מנתח המקרה, היכן הוא בוצע, תאריך האיסוף ומידע רלוונטי אחר. בחלק הבא של המטופל הירוק, יש לנו נתונים דמוגרפיים של המטופלים, כולל MRN לדוגמה, שם פרטי ושם משפחה של המטופל, המין שלהם, תאריך לידה עם חישוב אוטומטי של הגיל, הרוחביות של העין הפגועה וקטגוריית האבחון. טופס זה כולל לוגיקת הסתעפות, כך שכאשר תיבת סימון נבחרת, היא משפיעה על המראה של תיבות הסימון שמתחתיה.
במקרה זה, זהו קטע קדמי מקרה רשתית. אז ראשית, תיבת הרשתית האבחנה מאוכלסת. המתאם בחר כי מדובר בחור מקולרי וגם תיבת אבחון המקטע הקדמי אוכלסה.
במקרה זה, נראה כאילו מדובר בקטרקט. טופס היסטוריה קדם-אופ מאוכלס גם כתיבת טקסט חופשי. כאן, ניתן להעתיק ולהדביק מידע מה- EMR או להזין מידע חדש על היסטוריית טרום הניתוח לעיון עתידי.
לאחר מכן, בסעיף אדום זה, יש לנו את תיבת הפרוצדורה. במקרה זה, נראה כמו pars plana vitrectomy נבחר יחד עם IOL phaco. כל מה שאינו מאוכלס כאן באף אחת מתיבות הסימון הללו ניתן להזין בטקסט חופשי באמצעות תיבות אחרות אלה המפולפלות לאורך הטופס.
פרטים רלוונטיים על המקרה עצמו הושלמו גם הם. לבסוף, בקטע זהב זה, יש לנו אזור איסוף. שמו של המתאם האוסף את הדגימה יחד עם מספר צינורות הדגימה הנמצאים בשימוש הוזנו כאן.
שוב, באמצעות לוגיקת הסתעפות, אנו יכולים לאסוף כמה דוגמאות הדרושות למקרה. במקרה זה, נאספו שתי דגימות, נראה כמו ליבת זגוגית ודגימת נוזל חדר קדמי. הברקודים של כל אחת מהדגימות הללו נסרקו כאן ונרשמו בטופס.
לבסוף, יש קטע הערות איסוף לדוגמה שבו המתאם יכול להקליד פרטים רלוונטיים כולל נפחים ואיכות של הנוזל הנשאב. בחלק זה של העלאת קבצים סופיים, ניתן להעלות תמונות, סרטונים או תיעוד רלוונטיים לטופס עצמו ולקשר ביניהם. לבסוף, לאחר שהכל הושלם, המתאם יכול ללחוץ על שלח הבא והטופס נשמר עם כל המידע הרלוונטי מאוחסן, ולחבר את הדגימה בהצלחה עם המטופל.
מעבירים את הדגימות על קרח יבש מחדר הניתוח למעבדה. היכנס ל- REDCap במחשב המעבדה. קח את אחת הדגימות שנאספו וסרוק את הברקוד לתוך מסד הנתונים.
כעת, יש צורך במיכל שני עם קרח יבש ומתלה לבקבוקוני הקריו. גם הברקוד של ארון התקשורת ייסרק למסד הנתונים והדגימות יועברו לארון התקשורת. מיקום הבקבוקונים במדף מתווסף למסד הנתונים והערך נשמר ונסגר.
המתלה עם הבקבוקונים מועבר על קרח יבש למקרר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. המדף מתווסף למיקום מסוים במקרר באמצעות מערכת קואורדינטות. זה יאפשר מאוחר יותר לאחזר בקלות דגימות לניתוח במורד הזרם.
סרטון וידאו זה מהווה הדרכה לגבי טופס האחסון לדוגמה. כאן, אנו רואים את רשומת סקירת המטופלים. עיגול ירוק זה מציין שטופס הזנת אוסף הדגימות כבר הושלם.
עיגול ריק זה מציין שיש למלא טופס אחסון. יש למלא טופס אחסון עבור כל דגימה שנאספת בשלב טופס הכניסה. לחיצה על עיגול זה תעביר אותנו לטופס האחסון לדוגמה הראשון.
כאן אנו יכולים לראות שנוצר PID וה-MRN הוסווה. מידע זה עדיין נגיש וניתן לגשת אליו באמצעות הדף הקודם על ידי לחיצה על העיגול הירוק בטופס הכניסה. כאן תיווצר תמונת מצב של דגימה לאחר השלמת דף זה.
תחת הערות איסוף, אנו רואים שהמידע יובא באופן אוטומטי מטופס הכניסה. לאחר מכן, תחת תאריך ארכיון רשומות, אנו יכולים להזין את תאריך השלמת טופס זה. תחת ברקוד צינור דגימה, אנו סורקים או מזינים מחדש את הברקוד של הצינור המאוחסן בארכיון.
בזמן אמת, תמונת מצב זו מתעדכנת. בסעיף זה, אנו יכולים לבחור אם דגימה מועברת החוצה. כאן אנו מזינים את המידע הרלוונטי.
לצורך דוגמה זו, נציין כי מדובר בדגימה הנכנסת לאחסון ביולוגי פנימי. תחת אימות, מתאם מחקר יכול לחזור ולוודא שההסכמה האלקטרונית או הסכמת הנייר הושלמה בהצלחה ובמסגרת פרוטוקולים. שם האדם שמשלים אימות זה מוזן ובאמצעות רשימה נפתחת זו, המאמת מתאים את הברקוד כאן למה שהוקלד זה עתה.
זה מבטיח דיוק. לאחר מכן, בשלב מיקום זה, אנו רואים את המקפיא שבו הדגימה הולכת להיות מאוחסנת. אנו יכולים לציין את המדף שבו המדגם יאוחסן וכן להקליט את ברקוד התיבה, אותו ניתן לסרוק או להקליד.
ניתן גם להקליד כאן תווית קופסה וניתן למקם את התווית על הקופסה להתאמה נוספת. לאחר מכן שני המיקומים לפי שורה ועמודה נרשמים שניהם. זה מבטיח שכל ברקוד משויך למיקום בתוך התיבה שנרשם לאחזור קל בעתיד.
תחת סעיף שימוש זה, אנו יכולים להזין את שם הפרויקט שלנו או לבחור שם מתוך תיבה נפתחת. הקלט את נפח הדגימה. וכאן, התאריך והשעה, כמו גם המשתמש שניגש לאחרונה לטופס זה, מאוכלסים באופן אוטומטי כדי להבטיח שרשרת משמורת שניתן לבדוק ולבקר לפי הצורך.
האדם שמאחסן את הטופס בארכיון מזין את שמו כאן ומציין כאן הערות רלוונטיות שעשויות להתאים למה שהוא רוצה לרשום בטופס הזנה זה לאחסון. לבסוף, יש סעיף נוסף להעלאת קובץ, ולאחר שכל זה הושלם, ניתן למלא ולשלוח טופס זה על ידי לחיצה על שמור ויציאה, מה שמחזיר אותנו לסקירה הכללית של המטופל. עבור כל טופס נוסף שיש למלא, עבור כל צינור שיש לאחסן, אנו יכולים ללחוץ על כפתור פלוס זה כדי לחזור לטופס האחסון לדוגמה וליצור רשומה נוספת.
סקירה זו מספקת גישה לטופס הכניסה שנוצר וכן לכל טופסי האחסון הבאים עבור רשומת מטופל זו. בדרך זו, הוא ניתן לאחזור בקלות ונגיש על ידי כל מי שיש לו גישה עורפית או הרשאות נתונות אחרות בתוך REDCap. הביופסיות הנוזליות שנאספו יכולות להיות נתונות למגוון אנליזות מולקולריות כולל פרוטאומיקה, גליקומיקס ומטבולומיקה.
מסד הנתונים REDCap מאפשר שליפה פשוטה ומהירה של דגימות, למשל על ידי חיפוש דגימות מחולים עם מחלה ספציפית. מדובר במקרה של מטופלת בת 17 שהייתה מדוכאת חיסון והציגה דלקת ברשתית ובעצב הראייה. מחשש לזיהום, בוצעה ביופסיה נוזלית של הומור מימי ונשלחה לבדיקת DNA PCR.
התוצאות היו חיוביות עבור CMV ושליליות עבור HSV וטוקסופלזמוזיס והיו קריטיות כדי להבחין בין צורות זיהומיות ללא זיהומיות של דלקת תוך עינית ולבחור את הטיפול המתאים. ספקטרומטריית מסות של כרומטוגרפיה נוזלית מאפשרת ניתוח בלתי משוחד וכמותי למחצה של הפרוטאום. בביופסיה נוזלית מהזגוגית של מטופל שעבר ויטרקטומיה, הטכניקה הצליחה לזהות 484 חלבונים ייחודיים, כולל משלים C3, אופטיצין וקולגן מסוג 2.
שלוש ביופסיות נוזליות בזגוגית נותחו באמצעות מנתח מולטיפלקס גליקופרוטאומי. הבדיקה זיהתה פרופילי גליקוזילציה של 500 חלבונים אנושיים, ולוכדת מגוון מסלולים ביולוגיים כגון חילוף חומרים, תגובה חיסונית, הידבקות תאים וארגון אקטינים. ניתחנו גם את הפרופיל המטאבולומי של ביופסיות נוזליות של הומור מימי באמצעות צורה מיוחדת של ספקטרומטריית מסות.
זיהינו 292 מטבוליטים שונים בשלוש ביופסיות נוזליות מימיות של בני אדם. ניתוח מסלולים זיהה מגוון מסלולים מטבוליים, כולל מטבוליזם של חומצות אמינו, מחזור אוריה וסינתזה של קרניטין. לסיכום, תהליך העבודה שלנו יצר ממשק מעשי בין חדר הניתוח למעבדת המחקר המאפשר איסוף, ביאור ואחסון סטנדרטיים ובעלי תפוקה גבוהה של דגימות כירורגיות באיכות גבוהה.
הדגימות יכולות לשמש לאנליזה מולקולרית במורד הזרם, כולל פרוטאומיקה, גליקומיקס ומחקרים מטבוליים. הפרוטוקול שלנו מספק בסיס רב ערך למחקר תרגומי עתידי.
