İnsan gözünden sıvı biyopsilerin moleküler profillemesi, son derece uzmanlaşmış oküler dokulardan binlerce farklı molekül içeren lokal olarak zenginleştirilmiş sıvıları yakalayabilir. Canlı insanlarda oküler hastalıkların moleküler karakterizasyonuna ve yeni tanı ve tedavi stratejilerinin belirlenmesinde daha fazla potansiyele izin verirler. Burada, göz içi cerrahi sırasında yüksek kaliteli sulu mizah ve vitreus sıvı biyopsilerinin standartlaştırılmış toplanması ve biyobankacılığı için protokol geliştirdik.
Protokolün bir parçası, her bir numuneye kullanım ömrü boyunca açıklama eklemek için web tabanlı veri gizliliği uyumlu bir veritabanı ve her bir barkodlu numunenin depodaki konumunu izlemeye izin veren ve protein, glikan ve metabolit analizi gibi aşağı akış deneyleri için verimli numune alımı sağlayan bir koordinat sisteminin kullanılmasıdır. Bir ml şırıngaya bağlı 30 ila 32 gauge iğne kullanarak limbusa dik bir ön oda parasentezi gerçekleştirmek için bir ameliyat mikroskobu kullanın. Bu işlem sırasında gözü stabilize etmek için bir pamuk ucu kullanılabilir.
Göz içi yapılara zarar vermemek için iğnenin ucunun orta ön odadaki periferik irisin üzerinde kaldığından emin olun. Mikroskop aracılığıyla doğrudan görselleştirme altında, bir ml'lik bir şırınga kullanarak yaklaşık yüz mikrolitre seyreltilmemiş sulu mizahı manuel olarak aspire edin. İğne daha sonra ön odadan dikkatlice çıkarılır.
Fakik bir gözde, lense dokunmaktan kaçınmak için iğneyi irisin üzerinde tutun. Dünya üzerindeki pozitif baskı reflüyü artırabilir. İğne çekilmeden önce pamuk ucunun serbest bırakılması reflüyü azaltmaya yardımcı olur.
Tesisatçıyı geri çekin ve havanın ve toplanan sıvının nasıl hareket ettiğini görün. Şırıngayı kriyo şişesine enjekte edin. Ekstra hava, şırınganın ölü alanını temizler.
Burada şişeye kalıcı olarak kazınmış barkodu görebilirsiniz. Barkod daha sonra numuneyi ameliyathanedeki bir bilgisayarda REDCap formuna taramak için kullanılır. Kriyo şişesi derhal soğutma kutusundaki kuru buz üzerine aktarılacaktır.
Vitreus sıvı biyopsileri, eğitimli bir vitreoretinal cerrah tarafından vitrektomi başlangıcında elde edilebilir. Vitrektomi kesicinin sıvı ile astarlanmayacağını unutmayın. Vitröz boşlukta, seyreltilmemiş bir vitreus örneği toplamak için vitreus kesiciyi infüzyon olmadan aktive edin.
Vitröz ekstrüzyon kanülüne bağlı bir şırınga kullanarak 0.5 ila bir ml vitreusu manuel olarak aspire edin. Numune daha sonra doğru bir humeral numune için gösterdiğimiz gibi işlenir. Bu video, anket görünümünde REDCap'ta doldurulmuş bir örnek toplama formunun izlenecek yoludur.
Bir hasta bir klinik araştırma koordinatörünün yardımıyla e-rızasını tamamladıktan sonra, bu form doldurulur. Hastanın e-onay aldığı cihazla aynı cihazdan erişilebilir veya onaylanmış başka bir cihaz kullanılarak erişilebilir. İmzaların doğrulanması için tamamlanan e-onayın bir kopyasına buradan erişilebilir.
Koordinatör daha sonra onay türü de dahil olmak üzere diğer ilgili bölümleri doldurur ve bu mavi bölümde, vaka cerrahı, nerede yapıldığı, toplama tarihi ve diğer ilgili bilgiler gibi vakanın kendisiyle ilgili ayrıntıları doldurur. Bu bir sonraki yeşil hasta bölümünde, örnek bir MRN, hastanın adı ve soyadı, cinsiyeti, yaşın otomatik olarak hesaplanmasıyla doğum tarihi, etkilenen gözün yanallığı ve tanı kategorisi dahil olmak üzere hasta demografisine sahibiz. Bu form dallanma mantığına sahiptir, bu nedenle bir onay kutusu seçildiğinde, altındaki onay kutularının görünümünü etkiler.
Bu durumda, bu bir ön segment ve retina vakasıdır. Yani önce tanı retina kutusu doldurulur. Koordinatör bunun bir makula deliği olduğunu seçti ve ön segment tanı kutusu da dolduruldu.
Bu durumda, bir katarakt gibi görünüyor. Operasyon öncesi geçmiş formu da serbest metin kutusu olarak doldurulur. Burada, EMR'den gelen bilgiler kopyalanıp yapıştırılabilir veya ileride başvurmak üzere operasyon öncesi geçmişle ilgili yeni bilgiler girilebilir.
Ardından, bu kırmızı bölümde, prosedür kutusuna sahibiz. Bu durumda, a fako IOL ile birlikte bir pars plana vitrektomi seçilmiş gibi görünmektedir. Bu onay kutularının hiçbirinde burada doldurulmayan herhangi bir şey, form boyunca biberlenmiş bu diğer kutular kullanılarak serbest metin olarak girilebilir.
Davanın kendisiyle ilgili detaylar da tamamlanır. Son olarak bu altın bölümünde bir toplama alanımız var. Numuneyi toplayan koordinatörün adı ve kullanılan numune tüplerinin sayısı buraya girilmiştir.
Yine, dallanma mantığını kullanarak, servis talebi için gerektiği kadar örnek toplayabiliyoruz. Bu durumda, iki örnek toplandı, bir vitreus çekirdeği ve bir ön kamara sıvı örneği gibi görünüyor. Bu örneklerin her birinin barkodları burada taranmış ve forma kaydedilmiştir.
Son olarak, koordinatörün çekilen sıvının hacimleri ve kalitesi de dahil olmak üzere ilgili ayrıntıları yazabileceği bir örnek toplama notları bölümü vardır. Bu son dosya yükleme bölümünde, ilgili tüm fotoğraflar, videolar veya belgeler formun kendisine yüklenebilir ve bağlanabilir. Son olarak, her şey tamamlandığında, koordinatör bir sonraki gönder'e tıklayabilir ve form, numuneyi hastaya başarılı bir şekilde bağlayarak saklanan tüm ilgili bilgilerle birlikte kaydedilir.
Numuneleri kuru buz üzerinde ameliyathaneden laboratuvara taşıyın. Laboratuvar bilgisayarında REDCap'te oturum açın. Toplanan örneklerden birini alın ve barkodu veritabanına tarayın.
Şimdi, kuru buzlu ikinci bir kaba ve kriyo şişeleri için bir rafa ihtiyaç var. Rafın barkodu da veritabanına taranacak ve numuneler rafa aktarılacaktır. Şişelerin raftaki konumu veritabanına eklenir ve giriş kaydedilip kapatılır.
Şişelerin bulunduğu raf daha sonra eksi 80 santigrat derecede saklanmak üzere kuru buz üzerinde buzdolabına taşınır. Raf, bir koordinat sistemi kullanılarak buzdolabında belirli bir konuma eklenir. Bu daha sonra aşağı akış analizi için numunelerin kolayca alınmasına izin verecektir.
Bu video, örnek depolama formunun izlenecek yoludur. Burada hasta genel bakış kaydını görüyoruz. Bu yeşil daire, örnek toplama giriş formunun zaten doldurulduğunu gösterir.
Bu boş daire, bir depolama formunun doldurulması gerektiğini gösterir. Giriş formu aşamasında toplanan her numune için bir depolama formu doldurulmalıdır. Bu daireye tıklamak bizi ilk örnek depolama formuna götürecektir.
Burada bir PID üretildiğini ve MRN'nin maskelendiğini görebiliriz. Bu bilgilere hala erişilebilir durumdadır ve giriş formundaki yeşil daireye tıklayarak önceki sayfa kullanılarak erişilebilir. Burada, bu sayfa tamamlandıktan sonra bir örnek anlık görüntüsü oluşturulacaktır.
Koleksiyon notlarının altında, bilgilerin giriş formundan otomatik olarak içe aktarıldığını görüyoruz. Ardından, kayıt arşivleme tarihi altında, bu formun doldurulduğu tarihi girebiliriz. Numune tüp barkodu altında, arşivlenmekte olan tüpün barkodunu tarar veya tekrar gireriz.
Gerçek zamanlı olarak, bu örnek anlık görüntüsü güncelleniyor. Bu bölümde, bir numunenin dışarı aktarılıp aktarılmadığını seçebiliriz. Buraya ilgili bilgileri giriyoruz.
Bu örnek uğruna, bunun dahili biyodepo depolamasına giren bir örnek olduğunu belirteceğiz. Doğrulama altında, bir araştırma koordinatörü geri dönüp e-rızanın veya kağıt onayının başarıyla ve protokoller dahilinde tamamlandığını doğrulayabilir. Bu doğrulamayı tamamlayan kişinin adı girilir ve bu açılır menüyü kullanarak doğrulayıcı, buradaki barkodu az önce yazılanla eşleştirir.
Bu, doğruluğu garanti eder. Daha sonra, bu konum aşamasında, numunenin depolanacağı dondurucuyu görüyoruz. Numunenin depolanacağı rafı belirtebilir, ayrıca taranabilen veya yazılabilen kutu barkodunu kaydedebiliriz.
Buraya bir kutu etiketi de yazılabilir ve etiket daha fazla eşleştirme için kutuya yerleştirilebilir. Daha sonra satır ve sütuna göre iki konum kaydedilir. Bu, her barkodun gelecekte kolayca alınabilmesi için kaydedilen kutu içindeki bir konumla ilişkilendirilmesini sağlar.
Bu kullanım bölümünün altında, proje adımızı girebilir veya açılır kutudan birini seçebiliriz. Örnek hacmini kaydedin. Ve burada, tarih ve saatin yanı sıra bu forma en son erişen kullanıcı, gerektiğinde gözden geçirilebilecek ve denetlenebilecek bir gözetim zinciri sağlamak için otomatik olarak doldurulur.
Formu arşivleyen kişi buraya adını girer ve depolama için bu giriş formuna kaydetmek istedikleriyle tutarlı olabilecek ilgili notları burada belirtir. Son olarak, bir dosya yüklemek için başka bir bölüm var ve tüm bunlar tamamlandıktan sonra, bu form kaydet ve çık'ı tıklatarak doldurulabilir ve gönderilebilir, bu da bizi hastaya genel bakışa geri getirir. Doldurulması gereken her ek form için, depolanması gereken her tüp için, örnek depolama formuna geri dönmek ve başka bir kayıt oluşturmak için bu artı düğmesine tıklayabiliriz.
Bu genel bakış, oluşturulan giriş formunun yanı sıra bu hasta kaydı için sonraki depolama formlarına erişim sağlar. Bu şekilde, arka uç erişimi veya bir REDCap içinde verilen diğer izinlere sahip herkes tarafından kolayca erişilebilir ve erişilebilir. Toplanan sıvı biyopsiler proteomik, glikomikler ve metabolomikler dahil olmak üzere çeşitli moleküler analizlere tabi tutulabilir.
REDCap veritabanı, örneğin belirli bir hastalığı olan hastalardan örnekler arayarak örneklerin basit ve hızlı bir şekilde alınmasını sağlar. Bu olgu, immün sistemi baskılanmış, retina ve optik sinir inflamasyonu ile başvuran 17 yaşında bir kadın hastadır. Bir enfeksiyondan endişe duyulduğundan, sulu bir mizah sıvı biyopsisi yapıldı ve DNA PCR analizi için gönderildi.
Sonuçlar CMV için pozitif, HSV ve toksoplazmoz için negatifti ve enfeksiyöz olmayan göz içi inflamasyon formlarını ayırt etmek ve uygun tedaviyi seçmek için kritik öneme sahipti. Sıvı kromatografisi kütle spektrometresi, proteomun tarafsız ve yarı kantitatif bir analizini sağlar. Vitrektomi uygulanan bir hastanın vitreusundan yapılan sıvı biyopside, teknik, kompleman C3, optikin ve kollajen tip 2 dahil olmak üzere 484 benzersiz proteini tanımlayabildi.
Üç vitreus sıvı biyopsisi bir glikoproteomik multipleks analizörü kullanılarak analiz edildi. Tahlil, 500 insan proteininin glikozilasyon profillerini tespit etti ve metabolizma, bağışıklık tepkisi, hücre yapışması ve aktin organizasyonu gibi çeşitli biyolojik yolları yakaladı. Ayrıca, sulu mizah sıvı biyopsilerinin metabolomik profilini özel bir kütle spektrometrisi formu kullanarak analiz ettik.
Üç sulu insan sıvı biyopsisinde 292 farklı metabolit tanımladık. Bir yol analizi, amino asit metabolizması, üri döngüsü ve karnitin sentezi dahil olmak üzere çeşitli metabolik yolları tanımladı. Sonuç olarak, iş akışımız, ameliyathane ile araştırma laboratuvarı arasında, yüksek kaliteli cerrahi örneklerin standartlaştırılmış ve yüksek verimli toplanmasına, açıklanmasına ve depolanmasına olanak tanıyan pratik bir arayüz oluşturdu.
Numuneler, proteomik, glikomikler ve metabolomik çalışmalar dahil olmak üzere moleküler aşağı akış analizi için kullanılabilir. Protokolümüz, gelecekteki çeviri araştırmaları için değerli bir temel oluşturmaktadır.
