Biobanque de biopsies liquides aqueuses et vitrées humaines pour analyses moléculaires

Le profilage moléculaire des biopsies liquides de l’œil humain peut capturer des fluides localement enrichis contenant des milliers de molécules différentes provenant de tissus oculaires hautement spécialisés. Ils permettent la caractérisation moléculaire des maladies oculaires chez les humains vivants et d’autres possibilités d’identifier de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques. Ici, nous avons développé un protocole pour la collecte standardisée et la biobanque de biopsies de l’humeur aqueuse et du liquide vitreux de haute qualité pendant la chirurgie intraoculaire.

Une partie du protocole est une base de données Web conforme à la confidentialité des données pour annoter chaque échantillon au cours de sa durée de vie et l’utilisation d’un système de coordonnées qui permet de suivre l’emplacement de chaque échantillon à code-barres stocké, ce qui permet une récupération efficace des échantillons pour les expériences en aval telles que l’analyse des protéines, des glycanes et des métabolites. Utilisez un microscope opératoire pour effectuer une paracentèse de la chambre antérieure perpendiculaire au limbe à l’aide d’une aiguille de calibre 30 à 32 reliée à une seringue d’un ml. Une pointe en coton peut être utilisée pour stabiliser l’œil pendant cette procédure.

Assurez-vous que la pointe de l’aiguille reste au-dessus de l’iris périphérique dans la chambre antérieure médiane pour éviter d’endommager les structures intraoculaires. Sous visualisation directe au microscope, aspirer manuellement une centaine de microlitres d’humeur aqueuse non diluée à l’aide d’une seringue d’un ml. L’aiguille est ensuite soigneusement retirée de la chambre antérieure.

Dans un œil phaque, gardez l’aiguille sur l’iris pour éviter de toucher la lentille. Une pression positive sur le globe peut augmenter le reflux. Libérer l’embout de coton avant le retrait de l’aiguille aide à réduire le reflux.

Retirez le plombier et voyez comment l’air et le fluide collecté se déplacent. Injectez la seringue dans le flacon cryogénique. L’air supplémentaire nettoie l’espace mort de la seringue.

Ici, vous pouvez voir le code-barres qui est gravé en permanence sur le flacon. Le code-barres est ensuite utilisé pour numériser l’échantillon vers le formulaire REDCap sur un ordinateur de la salle d’opération. Le flacon cryogénique sera immédiatement transféré sur de la glace sèche dans la boîte de refroidissement.

Les biopsies de liquide vitreux peuvent être obtenues au début d’une vitrectomie par un chirurgien vitréo-rétinien qualifié. Notez que le coupe-vitrectomie ne sera pas amorcé avec du liquide. Dans la cavité vitrée, activer le coupe-vitré sans perfusion pour prélever un échantillon vitreux non dilué.

Aspirer manuellement 0,5 à un ml de vitré à l’aide d’une seringue reliée à la canule d’extrusion vitrée. L’échantillon est ensuite traité comme nous l’avons démontré pour un échantillon huméral précis. Cette vidéo est une présentation pas à pas d’un formulaire de collecte d’échantillons rempli dans REDCap en vue d’enquête.

Une fois qu’un patient a rempli le consentement électronique avec l’aide d’un coordonnateur de la recherche clinique, ce formulaire est rempli. Il est possible d’y accéder sur le même appareil que celui sur lequel le patient a obtenu son consentement électronique, ou il peut être consulté à l’aide de tout autre appareil approuvé. Une copie du consentement électronique qui a été rempli peut être consultée ici pour que les signatures soient vérifiées.

Le coordinateur remplit ensuite les autres sections pertinentes, y compris le type de consentement et dans cette section bleue, des détails sur le cas lui-même, tels que le chirurgien de cas, où il a été effectué, la date de la collecte et d’autres informations pertinentes. Dans cette prochaine section verte sur les patients, nous avons les données démographiques des patients, y compris un échantillon de MRN, le prénom et le nom du patient, son sexe, sa date de naissance avec un calcul automatique de l’âge, la latéralité de l’œil affecté et la catégorie de diagnostic. Ce formulaire comporte une logique de branchement, de sorte que lorsqu’une case à cocher est sélectionnée, elle affecte l’apparence des cases à cocher situées en dessous.

Dans ce cas, il s’agit d’un segment antérieur et d’un cas de rétine. Donc, d’abord, la boîte de diagnostic de la rétine est remplie. Le coordonnateur a choisi qu’il s’agit d’un trou maculaire et la boîte de diagnostic du segment antérieur a également été remplie.

Dans ce cas, on dirait que c’est une cataracte. Un formulaire d’historique préopératoire est également rempli sous forme de zone de texte libre. Ici, les informations du DME peuvent être copiées et collées ou de nouvelles informations sur l’historique préopératoire peuvent être entrées pour référence future.

Ensuite, dans cette section rouge, nous avons la boîte de procédure. Dans ce cas, on dirait qu’une vitrectomie pars plana a été sélectionnée avec la LIO phaco. Tout ce qui n’est pas rempli ici dans l’une de ces cases à cocher peut être entré en texte libre à l’aide de ces autres cases qui sont poivrées tout au long du formulaire.

Les détails pertinents sur l’affaire elle-même sont également complétés. Enfin, dans cette section d’or, nous avons une zone de collecte. Le nom du coordinateur qui a recueilli le spécimen ainsi que le nombre de tubes d’échantillons utilisés ont été saisis ici.

Encore une fois, en utilisant la logique de branchement, nous sommes en mesure de collecter autant d’échantillons que nécessaire pour le cas. Dans ce cas, deux échantillons ont été prélevés, ressemblant à un noyau vitreux et à un échantillon de liquide de la chambre antérieure. Les codes-barres de chacun de ces échantillons ont été scannés ici et enregistrés dans le formulaire.

Enfin, il y a une section de notes de collecte d’échantillons où le coordinateur peut taper des détails pertinents, y compris les volumes et la qualité du fluide prélevé. Dans cette dernière section de téléchargement de fichier, toutes les photos, vidéos ou documents pertinents peuvent être téléchargés dans le formulaire lui-même et liés. Enfin, une fois que tout est terminé, le coordinateur peut cliquer sur Soumettre suivant et le formulaire est enregistré avec toutes les informations pertinentes stockées, reliant l’échantillon avec succès avec le patient.

Transporter les échantillons sur glace sèche de la salle d’opération au laboratoire. Connectez-vous à REDCap sur l’ordinateur de laboratoire. Prenez l’un des échantillons collectés et scannez le code-barres dans la base de données.

Maintenant, un deuxième récipient avec de la glace sèche et un rack pour les flacons cryogéniques est nécessaire. Le code-barres du rack sera également scanné dans la base de données et les échantillons seront transférés sur le rack. La position des flacons dans le rack est ajoutée à la base de données et l’entrée est enregistrée et fermée.

Le support avec les flacons est ensuite transporté sur de la glace sèche au réfrigérateur pour un stockage à moins 80 degrés Celsius. Le rack est ajouté à une position spécifique dans le réfrigérateur à l’aide d’un système de coordonnées. Cela permettra plus tard de récupérer facilement des échantillons pour une analyse en aval.

Cette vidéo est une procédure pas à pas du formulaire de stockage d’exemples. Ici, nous voyons l’enregistrement de l’aperçu du patient. Ce cercle vert indique que le formulaire d’inscription au prélèvement d’échantillons a déjà été rempli.

Ce cercle vide indique qu’un formulaire de stockage doit être rempli. Un formulaire d’entreposage doit être rempli pour chaque échantillon prélevé au cours de la phase du formulaire d’inscription. En cliquant sur ce cercle, nous accéderons au premier formulaire de stockage d’échantillons.

Ici, nous pouvons voir qu’un PID a été généré et que le MRN a été masqué. Ces informations sont toujours accessibles et peuvent être consultées à partir de la page précédente en cliquant sur le cercle vert dans le formulaire d’inscription. Ici, un échantillon d’instantané sera généré une fois cette page terminée.

Sous les notes de collecte, nous voyons que les informations ont été importées automatiquement à partir du formulaire d’inscription. Ensuite, sous Date d’archivage des documents, nous pouvons entrer la date à laquelle ce formulaire est rempli. Sous le code-barres du tube de l’échantillon, nous scannons ou entrons à nouveau le code à barres du tube en cours d’archivage.

En temps réel, cet instantané du spécimen est en cours de mise à jour. Dans cette section, nous pouvons sélectionner si un échantillon est transféré. Ici, nous entrons ces informations pertinentes.

Pour les besoins de cet exemple, nous allons indiquer qu’il s’agit d’un échantillon qui va dans le stockage interne du bioréférentiel. Sous vérification, un coordonnateur de recherche peut revenir en arrière et vérifier que le consentement électronique ou le consentement papier a été rempli avec succès et dans le respect des protocoles. Le nom de la personne qui effectue cette vérification est entré et à l’aide de cette liste déroulante, le vérificateur fait correspondre le code à barres ici avec ce qui vient d’être tapé.

Cela garantit la précision. Ensuite, dans cette phase de localisation, nous voyons le congélateur où l’échantillon va être stocké. Nous pouvons indiquer l’étagère où l’échantillon sera stocké ainsi que le code à barres de la boîte, qui peut être scanné ou tapé.

Une étiquette de boîte peut également être tapée ici et l’étiquette peut être placée sur la boîte pour une correspondance ultérieure. Ensuite, les deux positions par ligne et colonne sont toutes deux enregistrées. Cela garantit que chaque code-barres est associé à une position dans la boîte qui est enregistrée pour une récupération facile à l’avenir.

Dans cette section d’utilisation, nous pouvons entrer notre nom de projet ou en sélectionner un dans une liste déroulante. Notez le volume de l’échantillon. Et ici, la date et l’heure ainsi que l’utilisateur qui a accédé à ce formulaire pour la dernière fois sont remplis automatiquement pour assurer une chaîne de traçabilité qui peut être examinée et auditée au besoin.

La personne qui archive le formulaire entre son nom ici et indique ici toutes les notes pertinentes qui peuvent être cohérentes avec ce qu’elle veut enregistrer dans ce formulaire d’entrée pour stockage. Enfin, il y a une autre section pour télécharger un fichier, et une fois que tout cela est terminé, ce formulaire peut être rempli et soumis en cliquant sur enregistrer et quitter, ce qui nous ramène à l’aperçu du patient. Pour chaque formulaire supplémentaire qui doit être rempli, pour chaque tube qui doit être stocké, nous pouvons cliquer sur ce bouton plus pour revenir au formulaire de stockage de l’échantillon et générer un autre enregistrement.

Cet aperçu permet d’accéder au formulaire d’inscription qui a été généré ainsi qu’à tous les formulaires de stockage ultérieurs pour ce dossier patient. De cette façon, il est facilement récupérable et accessible par toute personne disposant d’un accès backend ou d’autres autorisations données dans un REDCap. Les biopsies liquides collectées peuvent être soumises à une variété d’analyses moléculaires, y compris la protéomique, la glycomique et la métabolomique.

La base de données REDCap permet de récupérer des échantillons simplement et rapidement, par exemple en recherchant des échantillons de patients atteints d’une maladie spécifique. Il s’agit d’une patiente de 17 ans immunodéprimée qui présentait une inflammation de la rétine et du nerf optique. Préoccupé par une infection, une biopsie liquide de l’humeur aqueuse a été effectuée et envoyée pour analyse ADN PCR.

Les résultats étaient positifs pour le CMV et négatifs pour le VHS et la toxoplasmose et étaient essentiels pour distinguer les formes infectieuses des formes non infectieuses d’inflammation intraoculaire et choisir le traitement approprié. La spectrométrie de masse par chromatographie liquide permet une analyse non biaisée et semi-quantitative du protéome. Dans une biopsie liquide du vitré d’un patient subissant une vitrectomie, la technique a permis d’identifier 484 protéines uniques, dont le complément C3, l’opticine et le collagène de type 2.

Trois biopsies liquides vitreuses ont été analysées à l’aide d’un analyseur multiplex glycoprotéomique. Le test a détecté les profils de glycosylation de 500 protéines humaines, capturant une variété de voies biologiques telles que le métabolisme, la réponse immunitaire, l’adhésion cellulaire et l’organisation de l’actine. Nous avons également analysé le profil métabolomique des biopsies liquides à humeur aqueuse à l’aide d’une forme spéciale de spectrométrie de masse.

Nous avons identifié 292 métabolites différents dans trois biopsies liquides humaines aqueuses. Une analyse des voies a identifié une variété de voies métaboliques, y compris le métabolisme des acides aminés, le cycle de l’urie et la synthèse de la carnitine. En conclusion, notre flux de travail a établi une interface pratique entre la salle d’opération et le laboratoire de recherche qui permet la collecte, l’annotation et le stockage standardisés et à haut débit d’échantillons chirurgicaux de haute qualité.

Les échantillons peuvent être utilisés pour l’analyse moléculaire en aval, y compris la protéomique, la glycomique et les études métabolomiques. Notre protocole fournit une base précieuse pour la recherche translationnelle future.