정의된 분화 시스템을 사용하여 만능 줄기 세포에서 간 선조 사양

요약

이 문서의 목표는 만능 줄기 세포로부터 인간 간 선구분화를 유도하는 표준화된 접근법을 제공하는 것입니다. 즉시 사용 가능한 미디어 제형이 있는 이 절차의 개발은 사용자에게 생체 의학 연구 및 번역을 위한 인간 간 세포를 생성하는 촉진 시스템을 제공합니다.

초록

간 질환은 증가하는 글로벌 건강 문제입니다. 간 이식은 치료의 효과적인 모드인 동안, 기증자 기관 가용성에 있는 부족으로 인해 환자 사망률이 증가했습니다. 장기 부족은 또한 기본적인 연구 및 진료소를 위한 인간 간세포의 일상적인 공급에 영향을 미칩니다. 따라서 인간 간 전구 세포의 재생 가능한 소스의 개발이 바람직하며이 연구의 목표입니다. 인간 간 전구를 대규모로 효과적으로 생성및 배치할 수 있도록, 재현가능한 간 선조 분화 시스템이 개발되었다. 이 프로토콜은 다양한 세포 배양기 형식의 사용자 간의 실험 재현성을 돕고 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주를 사용하여 분화를 허용합니다. 이들은 기본적인 연구를 강화하고 임상 제품 개발을 향해 길을 열 수 있습니다 현재 분화 시스템에 비해 중요한 장점이다.

서문

간 질환은 전 세계적으로 연간 약 2백만 명의 사망을 초래하는 글로벌 건강 문제를 나타냅니다^1. 많은 모델 시스템이 간 질환을 연구하고 임상적으로 개입하기 위해 존재하지만, 세포 기반 시스템의 일상적인 사용은 상당한 단점에 의해 제한됩니다 (검토를 위해 Szkolnicka 외.²참조). 첨단 인간 다능성 줄기세포(hPSC) 배양 및 체세포 분화 방법은 클리닉^3,4를위한 분화세포의 기본 생체 의학 연구 및 재생 가능한 공급원을 위한 도구를 개발하는 유망한 기술을 나타낸다.

현재까지, 간세포형 세포(HLC)를 위한 다중 프로토콜이 개발되었다^5,6,7,8. 이러한 프로토콜은 작은 분자와 성장 인자의 조합을 사용하여 인간 간 발달의 측면을 재현하려고^9,10. 대부분의 프로토콜은 hPSC가 최종 종말에 준비되어 있는 단계별 분화 과정으로 구성되며, 그 다음으로 간 선조 사양^11,12,13,HLC 사양으로 끝납니다. 이러한 프로토콜에 의해 생성된 HLCs는 태아와 성인용 표현형의 혼합물을 표시합니다. 여기에는 HNF4α 및 알부민(ALB)과 같은 간세포 마커와 같은 알파 페토프로틴(AFP)의 발현뿐만 아니라 약물 대사^{용량(14,15,16)이 포함됩니다.} 실험실 간에 HLC 분화는 다를 수 있습니다. 따라서 표준화된 프로토콜의 개발이 필요합니다. 이를 통해 연구자들은 기본 및 임상 연구를 위해 줄기 세포 에서 파생된 HLC를 대규모로 효과적으로 생성하고 적용할 수 있습니다.

간 선구분화 시스템은 따르기 쉬운 지침을 사용하여 인간 배아 및 유도된 만능 줄기 세포주 모두에 적용될 수 있는 개발되었다. 이 절차는 세포 배양 플라스크에서 96 개의 웰 플레이트에 이르기까지 다양한 배양기 형식으로 간 선조의 균질한 인구를 산출합니다. 아래 제공된 프로토콜은 줄기 세포 유래 간 선조를 24 및 96 웰 포맷으로 생산하는 프로토콜이다.

아래에 제시된 프로토콜에 사용되는 세포 밀도는 각각 24 및 96 웰 플레이트의 한 웰에 대해 지정됩니다(표 1참조). 상이한 세포 배양 플레이트 포맷 및 세포주에 대해 시작 세포 수의 최적화가 요구된다. 프로토콜 최적화를 위한 제안된 시작 세포 밀도는 2 x 10⁵ 세포/cm^2이다. 밀도 최적화를 위해, 한 번에 50,000개의 세포/cm^2를 ± 추가하여 여러 세포 밀도를 테스트할 수 있습니다.

프로토콜

1. 라미닌-521에 인간 다능성 줄기 세포 (hPSC) 유지 보수

1. 인간 다능성 세포(hPSC)를 라미닌-521(LN-521)에 6웰 플레이트에서 37°C 및 5%_CO2로 유지한다. 줄기세포 유지보수 배지(즉, mTeSR1 배지)의 2mL로 매일 세포를 공급하여 6웰 플레이트당 분화를 위해 선택한 종자일(일 0)까지 공급한다.
2. 세포 수확 전에 70-80%의 원하는 세포 합류가 달성되는지 확인하십시오.

2. 라민-521 멀티웰 준비 및 차별화를 위한 hPSC 시드

참고: HPSC의 경우 LN-521(예를 들어, 마트리겔 또는 섬유네틴)에 유지되지 않는 hPSC를 LN-521및 문화로 분할하여 1주 동안 의^공정의효율을 향상시키기 위해 월화 및 분화를 유도한다^15,17,18.

1. 라미닌 코팅 플레이트 준비
   1. 재조합 LN-521(100 μg/mL)의 바이알을 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 해동한다.
   2. Ca²⁺/Mg^{2 +}얼음 차가운 1x DPBS에서 해동 된 LN-521을 희석하여 8 μg / mL 솔루션을 준비하십시오.
   3. 8 μg/mL LN-521 용액의 0.25mL을 24웰 플레이트 또는 0.05 mL의 각 웰에 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. LN-521 용액으로 접시를 좌우로 부드럽게 흔들어 우물을 고르게 코팅합니다.
      참고: 96웰 플레이트 형식의 경우, 반자동 파이프라인을 사용하여 볼륨 디스펜싱, 셀 파싱 및 중간 변화를 수행할 수 있습니다. 자세한 내용은 메세게르 리폴스 외^19를참조하십시오.
   4. LN-521 코팅 플레이트를 반투명하고 유연한 필름으로 밀봉하고 사용하기 전에 밤새 4 °C에 보관하십시오.
      참고: LN-521 코팅 플레이트는 4°C에 보관할 때 최대 2주 동안 사용할 수 있습니다. 라미닌 코팅 된 우물의 건조를 피하십시오.
2. 세포 파종 당일, 30-60분 동안 37°C에서 세포 배양 배양에서 미리 코팅된 플레이트를 예열한다.
3. LN-521 솔루션을 흡인합니다.
   참고: LN-521 코팅의 손상을 방지하기 위해 우물 바닥과 흡인기의 직접적인 접촉을 피하십시오.
4. 줄기세포 유지보수 배지0.5mL을 새로 보충하여 10μM Rho 관련 키나아제(ROCK) 억제제 Y27632를 각각 24웰 플레이트 또는 0.05mL의 각 웰에 96웰 플레이트의 각 웰에 분배한다. 세포 시드를 준비할 때까지 접시를 인큐베이터에 놓습니다.
5. 예정된 시드일(0일)과 70~80%의 hPSC 합류로, 6웰 플레이트의 우물 바닥에 자발적인 분화 부위를 표시한다.
   참고: 자연분화는 위상 조영 현미경을 사용하여 세포 크기 및/또는 상이 다른 세포 형태학의 존재에 있는 총 변화에 의해 시각화될 수 있습니다.
6. 흡인 및 차별화의 표시된 영역과 우물에서 소비 된 매체를 폐기합니다. 실온(RT)에서 Ca²⁺/Mg²⁺ 없이 DPBS 1mL로 각각 잘 씻으십시오.
7. 효소가 없는 해리 시약 1mL(재료 표참조)를 각 우물에 넣고 37°C에서 8-10분 동안 배양하여 세포가 플레이트에서 눈에 띄게 분리될 때까지 배양합니다.
8. 셀 스크레이퍼를 사용하여 우물에서 세포를 부드럽게 분리합니다. P1000 파이펫으로 각 웰의 내용내용이 2-4배 위아래로 피펫되어 단일 셀 서스펜션을 생성합니다. 각 세포주에 대해, 모든 유지 보수 우물에서 멸균 50 mL 튜브로 풀 셀.
9. 줄기 세포 유지 보수 매체의 1 mL로 비워 각 세척. 적절한 세포주로부터 풀링된 세포를 포함하는 해당 튜브에 세체를 추가합니다.
10. 각 세포주에 대해 풀로 풀린 샘플에서 3개의 실행 가능한 셀 카운트를 수행합니다. 각 세포주에 대한 평균 라이브 셀 수(라이브 셀/mL)를 계산합니다.
11. 원심분리기는 RT에서 5분 동안 250 x g의 풀이 된 샘플을 흡인한 다음, 10 μM ROCK 억제제 Y27632로 새롭게 보충된 RT 줄기 세포 유지 보수 매체의 1-3mL에서 세포 펠릿을 재연합니다.
12. 각 세포주에 대해, 2.4 단계에서 준비된 우물수당 필요한 셀 수를 계산한다(표 1참조). 10 μM ROCK 억제제 Y27632로 새롭게 보충된 줄기 세포 유지 보수 매체로 필요한 세포 번호를 다시 중단합니다.
13. 이전에 추가된 볼륨을 제거하지 않고 2.4 단계에서 준비된 미리 코팅된 플레이트의 우물에 계산된 볼륨(들)을 추가합니다. 웰당 총 부피는 24웰 플레이트의 경우 1mL, 96웰 플레이트의 경우 0.1mL입니다. 접시를 좌우로 앞뒤로 부드럽게 흔들어 우물 전체에 세포 분산도 보장합니다.
    참고: 우물 을 가로지르는 균등한 세포 분포는 균질성 세포 파종과 성공적인 분화를 보장하는 열쇠입니다.
14. 시드 플레이트를 인큐베이터에 넣고 시드 플레이트를 앞뒤로 부드럽게 흔들어 세포를 균등하게 분배하고 37°C 및 5% CO_2에서배양을 유지한다.

3. 라미닌-521에 간 선조에 hPSC를 차별화

1. 올바른 첨가물로 보충된 Endoderm 기저매체를 사용하여 최종 엔도름 유도(1단계)를 위한 미디어를 준비한다.
   1. 0일째에는 엔도름 기저형의 병을 4°C에서 하룻밤 동안 해동한다.
   2. 필요에 따라 1단계 중간 1단계(1일째 에 사용)를 준비합니다.
   3. 해동 보충 MR 및 얼음에 보충 CJ.
   4. 희석 보충 MR 및 보충 CJ 1:100 엔도름 기초 매체에.
   5. 필요에 따라 2-4일에 사용할 수 있는 1단계 중간 2단계를 준비합니다.
   6. 희석 보충 CJ 1:100 엔도름 기초 매체에.
2. 후속 간 선조 세포 사양(2단계) 분화를 위한 배지를 준비하여 간 선조 배지를 이용하여 한다.
   1. 4일째에는 4°C에서 하룻밤 사이에 선조중의 병을 해동한다.
      참고: 1% 페니실린/연쇄절제술(IU/mL 100μg/mL의 최종 농도)이 이 실험에 사용되었다. 항생제는 필요하지 않습니다; 항생제 사용은 사용자 재량에 따라 사용됩니다.
3. 분화 첫날, 웰에서 10 μM ROCKi Y-27632 배지로 소비된 줄기세포 유지 보수 매체를 제거하고, 웰당 24개의 웰 플레이트당 0.5mL, 96웰 플레이트당 0.1mL로 대체한다.
4. 2일, 3일, 4일에는, 소비된 매체를 제거하고 96웰 플레이트당 24웰 플레이트 또는 0.1mL당 잘 1단계 중간 2의 0.5mL로 각각 잘 공급한다.
5. 5일째에, 면역 세포화학을 통한 최종 내분분 분석에 대한 우물을 수정한다. 나머지 우물의 경우, 소비된 배지를 제거하고 각각 0.5mL의 간 선조 분화 배지를 잘 공급하여 24웰 플레이트 또는 96웰 플레이트당 0.1mL에 대해 잘 한다. 6일, 7일, 9일에 다시 배지를 새로 고칩니다.
6. 10일째에, 간 선조 분화 분석을 위한 우물을 수확하거나 추가 간세포 와 같은 세포 분화를 진행한다.
   참고: 이 시점에서, 시료는 면역세포화학 분석을 위한 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정되거나, 엘리사및 세포를 위해 수집된 수퍼나일제는 단백질 정량화를 위해 수집되었다.

4. 라미닌-521에 hPSC에서 생성된 간 선조 분화 배양의 특성화

1. 5일째에 면역스테인링을 사용하여 최종 엔도름 특이적 마커의 발현을 감지합니다.
2. 10일째에 면역염색을 사용하여 간 선조 특이적 마커의 발현을 감지한다.
3. 10일, 제조사의 지시에 따른 키트를 사용하여 ELISA를 통한 AFP 및 ALB 분비를 측정하고, 비신천산(BCA) 단백질 분석서에 의해 결정된 대로 mg 단백질당 정상화한다.
4. 잘 결합된 HNF4α 양성세포의 백분율을 정량화하여 96웰 플레이트의 간 전구 가변성을 평가한다.

5. 면역 세포 화학 및 이미지 수집

1. 5일과 10일, 1x DPBS로 3배, 웰당 0.5mL, 웰당 0.1mL로 96웰 플레이트. RT에서 2-5 분 동안 부드러운 흔들림으로 접시를 배양하십시오.
   참고: 면역 세포화학에 대해 Ca²⁺/Mg²⁺ 없이 DPSB를 사용하십시오.
2. 15-30분 동안 RT에서 4%의 파라포름알데히드(PFA)로 세포를 고정하여 우물당 0.3mL의 PFA를 24웰 플레이트에 추가하고 96웰 플레이트당 0.1mL를 첨가한다.
3. 5.1 단계에서 설명한 대로 1x DPBS로 3배 세척합니다.
4. PBST로 멤브레인을 0.1% Tween, 1x DPBS를 사용하여 멤브레인을 20분 동안 배양하고, 96웰 플레이트당 24개의 웰 플레이트당 PBST0.3mL, 0.1mL를 추가하여 RT에서 20분 동안 배양합니다.
5. 1 시간 동안 PBST에서 10% BSA로 세포를 배양하고, 우물당 0.3mL의 BSA를 추가하고 96웰 플레이트당 BSA의 0.1mL을 추가하여 플레이트 셰이커를 사용하여 부드럽게 흔들어 줍니다.
6. 단백질 차단 후, 차단 용액을 PBST에서 1% BSA로 희석된 1차 항체로 대체하고 4°C에서 하룻밤 동안 부드러운 흔들림으로 배양한다.
   참고: 단백질 블록과 항체 첨가 사이에 세척하지 마십시오.
7. 24 시간 후, PBST와 함께 3 배 우물을 씻으라.
8. PBST에서 1% BSA에 이차 항체를 추가합니다. 부드러운 흔들림으로 어둠 속에서 RT에서 1 h를 배양하십시오.
9. 이차 항체 인큐베이션 후, 1x DPBS로 우물 3배를 씻고, 부드러운 흔들림으로 어둠 속에서 RT에서 10분 동안 제조업체의 지시에 따라 Hoechst 얼룩을 분배하십시오.
10. 1x DPBS로 3배 세척합니다. 플레이트는 이제 이미징을 할 준비가 되었습니다.
    참고: 이미징까지 어두운 4°C에 접시를 저장합니다.
11. 면역 조직 화학 후 고함량 이미징 현미경을 사용하여 다중웰 플레이트를 이미지합니다. 여러 뷰 필드의 이미지 수집은 우물의 진정한 표현을 얻는 것이 좋습니다. 상이한 마커의 발현은 상용 소프트웨어를 이용한 세포 세분화 분석을 통해 평가하였다(재료표참조)(도 1).
    참고: 셀 프로파일러 또는 피지^20,21과같은 이미지 분석 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 셀 세분화도 수행할 수 있다.

결과

hESC(H9) 및 hiPSC(P106) 라인에서 간 선조 분화는 도 2에기재된 단계별 프로토콜에 따라 수행되었다. 여기서, 만능 줄기 세포는 분화의 개시 전에 LN-521 코팅 판으로 단하나 세포로 종자하였다. 세포 합류는 견고하고 재현 가능한 분화를 위한 핵심입니다. 일단 올바른 합류가 달성되면(그림 2),차별화가 시작되었다. 5일째에, 최종 엔도름 사양은 Sox17 발현을 통해 평가되었다. 두 세포주에서 Sox17은 H9 및 P106에 대해 Sox17 양성 세포의 0.5%± 0.5%와 87.8%로 각각 80%± 높게나타났다(그림 3). 10일째에, 간 선조는 조약돌 같이 모양체를 표시했습니다(그림 2). 또한, 간 선조 사양은 HNF4α, AFP, ALB 및 사이토케라틴-19(CK19) 발현뿐만 아니라 AFP 및 ALB 단백질 분비^10,15,22(도 4)에대해 평가되었다. H9과 P106 간 배구모두 HNF4α(91% ± 0.5%, ± 0.2%), AFP(89.7% ± 1.8%, ± 1.2%), CK19(78.5%± 3.2%, 83.6%)±.8%)과 같은 태아간 마커를나타냈다. AFP 분비액은 10일째 에 두 세포주(32.4± 1.6 및 47.8 ± 5.9 ng/mL/mg/24h)에서 검출되었다(그림5). 알부민 합성은 낮은 수준(30.7% ± 1.8%, 27.2% ± 1.1%)으로 관찰되었으며ELISA(그림4)를통해 검출되지 않았다.

이 프로토콜은 24웰에서 96개의 웰 플레이트까지 간 선조의 표준화된 생산을 허용했습니다. 반자동 파이프라인은 H9 및 P106 세포주로부터 96개의 잘 플레이트를 생산하기 위해 이전에 설명된^17과같이 사용되었다. 세포 수 가변성 및 간 선조 분화 효율은 HNF4α 발현의 정량화를 통해 평가되었다. 세포 세분화는 고함량 이미징기기(도 1)를이용하여 면역형광을 통한 단백질 정량화를 위해 수행되었다. 10일째에, 간 선조들은 H9에 대해 HNF4α 양성세포의 94% >94%, P106에 대한 HNF4α 양성세포 97%를 가진 행에 걸쳐 유의한 가변성을 나타내지않았다(그림 6).

도 1: 세포 세분화 파이프라인 개요. (A)원이미지를 사용하여(B)핵 염색이 핵 분할에 사용되었다. (C)형상 및 크기에 기초한 핵 세분화 품질 관리 단계는 명확하게 분할된 핵을 정량화하기 위해 수행되었다. (D)이에 따라 양성 HNF4α-스테인드 핵을 정량화하였다. (E)마지막으로, 강도 기반 임계값은 HNF4α-발현 세포를 식별하기 위해 사용되었다. C와 E에서,녹색 핵은 선택된 세포를 나타내고 마젠타 핵은 버려진 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2: hPSC로부터의 간 선조 분화. (A)간 선구 분화 프로토콜의 회로도 표현. (B)분화 시 형태학적 변화를 강조하는 대표적인 이미지. 0일째(D0)에서 hPSC는 셀의 포장된 단층층을 제시했습니다. 이에 따라 hPSC는 5일째(D5)에 최종 엔도드름으로 준비되었습니다. 이것은 10일째 (D10)에 간 선조 분화에 선행되었습니다. 간 선조는 조약돌 같은 세포 형태를표시했다. 스케일 바 = 75 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 최종 엔데덤 사양의 특성화. 5일째에, 세포는 Sox17, 결정적인 엔도드름 마커를 위해 염색되었습니다. Sox17 양성 세포의 비율은 80 ± H9에 대 한 0.5% 및 87.8 p106에 대 한 0.5%±. 백분율 정량화는 10개의 개별 우물을 기반으로 하며, 6개의 필드가 잘 볼 수 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM. Scale 막대 = 50 μm로 표시됩니다.

그림 4: 간 선조 특성. 10일째에, 간 선조들은 간마커(A)HNF4α,(B)AFP 및(C)ALB를 위해 염색되었다. H9의 경우, 양성세포의 비율은 각각 91%, ± 0.4%, 89.7%± 1.8%, 30.7%로 HNF4α, AFP, ALB의 경우 각각 1.8%±. P106의 경우, 양성 세포의 비율은 각각 HNF4α, AFP 및 ALB에 ± 대해 각각 0.2%, 86% +/- 1.2%, 27.2%± 90%였다. (D)Cholangiocyte 계보 잠재력은 CK19 발현을 통해 평가되었다; H9 유래 간 선조는 3.2% CK19 양성 세포를 ± 78.5%를 표현한 반면, 83.6%는 CK19 양성 세포의 ± 1.8%가 P106 간 선조인을 관찰하였다. 면역글로불린 G(IgG) 염색은 염색 제어로서 사용하였다. 백분율 정량화는 10개의 개별 우물을 기반으로 하며, 6개의 필드가 잘 볼 수 있습니다. 데이터는 평균 ± SEM. Scale 막대 = 50 μm로 표시됩니다.

그림 5: 간 선조 단백질 분비 분석. 알파 페토프로틴(AFP)과 알부민(ALB)의 분비액은 H9과 P109에서 10일째에 간 선조 배양에서 분석되었다. 데이터는 3개의 생물학적 복제를 나타내고 오류 바는 SD를 나타내고, 분비단백질은 단백질의 mg당 mL당 분비 단백질의 나노그램으로서 24h 배양 배지로부터 정량화되었다, n = 3; ND = 감지되지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: 96 웰 플레이트에서 잘 가변성 평가. (A)HNF4α로 염색된 H9 유래 간 선조의 96웰 플레이트 뷰의 시각화. (b)HNF4α 양성 세포의 정량화. 잘 정량화 당 보기의 여섯 필드에서 행에서 잘 당 셀 수의 평균. 플레이트 전체의 평균 세포 수는 94.81%± 0.22 SEM HNF4α-양수 세포당 양수였다. 우물 사이에통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았다. (C)HNF4α로 염색된 P106 유래 간 선조의 96웰 플레이트 뷰의 시각화. (D)HNF4α 양성 세포의 정량화. 우물당 평균 셀 수( 잘 및 정량화된 6개의 시야 필드)에서 행의 평균 셀 수입니다. 플레이트 전체의 평균 세포 수는 97.7%± 0.57 SEM HNF4α-양수 세포당 양수였다. 행 간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다. 웰 H12는 면역글로불린 G(IgG) 염색 제어로 사용되었다. 스케일 바 = 1mm. 투키의 포스트 혹 이후 통계 시험을 통해 일방적인 ANOVA가 채택되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

플레이트 형식	표면적(cm2)	cm2당 세포	우물당 총 세포	디스펜싱 볼륨(mL)	세포 농도(세포/ml)
24웰 플레이트	1.9	210526	400000	0.5	800000
96웰 플레이트	0.32	187500	60000	0.05	1200000

표 1: 이 프로토콜에 사용되는 hPSC 세포주상이 다른 플레이트 포맷에 대해 권장되는 세포 밀도.

토론

대규모로 만능 줄기 세포로부터 인간 간 전구 세포의 생성은 시체 유래 물질에 대한 유망한 대안을 나타낼 수 있습니다. 프로토콜 표준화 및 재현성은 생체 의학 연구에 대한 기술 번역 및 영향을 보장하는 데 핵심적입니다. 이를 해결하기 위해, 이전 작품은 정의된 첨가제 및 매트릭스 15,^{23,24,25,26,27,28을}사용하여 hESC 및 iPSC로부터 단계적 차별화 프로토콜을 개발하는 데^{주력하고 있다.} 이를 통해, 간세포 표현형 및 재현성이 개선되어 분화^{공정(19)의}반자동화를 허용한다. 제시된 시스템은 기성 세포 배양 매체 및 촉진 간세포 분화 시스템과의 조합으로 강화됩니다.

이전에는 분화 프로토콜이 시작되기 전에 만능 세포 밀도가 간 선조 세포의 균질한 집단을 달성하기 위한 핵심 변수로^{강조되었다(26)}. 이러한 보다 정제된 절차를 이용하여, 다양한 세포밀도(표 1)를이용하여 단계적으로 줄기세포 유래 간 전구체를 단계적으로 생성할 수 있다. 5일째, 최종 엔도름 유도는 Sox17염색(도 3)에의해 검증되었다. 최종 엔도름으로 효율적이고 견고한 분화는 테스트된 ESC 및 iPSC 라인 모두에서 달성되었으며, 80% 이상이 Sox17(그림3)을발현했습니다. 10일째에, 간 선조들은 균일한 조약돌 같이 형태를 보였고, 간 줄기세포 마커는 AFP와 HNF4α(>86%, 도 4)에대해 높게 농축되었다. 수동 및 반자동 기술의 조합을 사용하여 다중 플레이트^{포맷(19)에서}차별화를 수행할 수 있었다.

현재 의 형태로, 세포 분화는 시험관 내 실험에 적합합니다. 그러나, 세포 농축은 간 선조의 균질한 인구가 납품을 위해 준비된다는 것을 확인하기 위하여 임상 신청 의 앞에 요구될 것입니다.

결론적으로, 여기서 설명된 프로토콜은 대규모로 간 선조를 생성하는 표준화된 접근법을 필드에 제공한다. 향후 작업은 후속 HLC 차별화, 성숙 및 유지 보수를 위한 새로운 매체의 생산에 초점을 맞출 것입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
DPBS with Calcium and Magnesium	ThermoFisher	14040133
Gentle cell dissociation reagent	STEMCELL Technologies	7174
Hoechst 33342 Ready Flow Reagent	thermofisher	R37165
Human Recombinant Laminin 521	BioLamina	LN521-02
Human Serum Albumin ELISA	Alpha Diagnostics	1190
Human Serum Alpha Fetoprotein ELISA	Alpha Diagnostics	500
mTeSR1 medium	STEMCELL Technologies	5850
Operetta High-Content Imaging System	PerkinElmer	HH12000000
PBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher	14190250
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140122
Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632	Sigma-Aldrich	Y0503-1MG
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement CJ	STEMCELL Technologies
STEMdiff Definitive Endoderm Supplement MR	STEMCELL Technologies
STEMdiff Endoderm Basal Medium	STEMCELL Technologies
STEMdiff Hepatic Progenitor Medium	STEMCELL Technologies
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416
Antibodies
Albumin	Sigma-Aldrich	A6684	1:200 (mouse)
Alpha-fetoprotein	Sigma-Aldrich	A8452	1:400 (mouse)
HNF-4α	Santa Cruz	sc-8987	1:400 (rabbit)
IgG	DAKO		1:400
Sox17	R&D Systems, Inc.	AF1924	1:200 (Goat)
Software
Columbus Image Data Storage and Analysis system	PerkinElmer