이 작품은 미국 심장 협회 (AM), 미국 국방부 (BC074986), 보스턴 어린이 병원 교수 경력 개발 원정대 (TM, AM)에서 기금에 의해 지원되었다. 저자는 기술 지원을 아만다 장과 엘리자베스 지앙 감사합니다.

참고 : 생체 내 동물 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서의 권장 사항을 엄격히 준수하여 실시 하였다. 이 프로토콜은 검토하고 보스턴 아동 병원의 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 번호 : 13-10-2526R, 14-02-2568R)에 의해 승인되었다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 약물은 제약 학년이며,이 약은 무균 상태에서 제조된다. 1. 섬유소 젤 준비 <ol><li> VEGF와 bFGF에 포함되어 섬유소 젤을 준비합니다. <ol><li> 실온까지 -80 ° C (25 ℃)에서 저장된다 피브리노겐과 트롬빈 녹여 원액. </li><li> 피브리노겐에 (0 ~ 100 NG / ml의 최종 농도), 염화칼슘 (2) (최종 농도 45 mM의), VEGF (최종 농도 0 ~ 100 NG / ㎖)과의 bFGF : 트롬빈 (2.5 U / ml의 최종 농도)를 추가합니다 솔루션 (최종 농도 0.9 %의 sodiu 12.5 ㎎ / ㎖m 1.5 ML 튜브에 염화물 용액 43 ~ 45). </li><li> 피펫으로 가볍게 섞는다. </li><li> 부드럽게 P200 피펫 팁을 사용하여 드롭 현명한 방식으로 멸균 플라스틱 접시에 혼합물의 200 μl를 피펫. </li><li> 그들은 응고 될 때까지 30 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 방울을 품어. 주 : 겔이 고체화 주입 (도 1a) 전에 몇 시간 동안 실온 (25 °의 C)에서 밀봉 된 플라스틱 접시에 유지 될 수있다. </li></ol></li><li> 주입하기 전에 작은 수술 가위를 사용하여 약 3 × 3 × 3mm 큐브에 섬유소 젤 트림. </li></ol> 2. 마우스 준비 <ol><li> 복강에 케타민 (100 ㎎ / ㎏)과 자일 라진 (10 ㎎ / ㎏)의 (IP) 주입을 성인 마우스 (8~12주)를 마취와 마우스가 적절하게 마우스의 발가락을 곤란하게하여 마취되어 있는지 확인합니다. <ol><li> 실험 기간 동안 건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 수의사 연고를 사용합니다. </li></ol></li><li> 애프터 셰 이브 쿵푸마우스의 흉곽의 좌측을 통해 R. </li><li> 마우스의 기관 내 삽관을 수행합니다. </li><li> 삽관에 마우스가 70 °로 각도 서서 스탠드 상단에있는 작은 고무 밴드를 통해 상부 앞니를 후킹하여 위치에 마우스를 잡아 놓습니다. </li><li> 조심스럽게 무딘 집게를 사용하여 한쪽으로 혀를 집어 넣으. </li><li> 광섬유 구즈넥 현미경 조명의 도움으로 후두를 시각화. </li><li> 기관에 기관 탄성 카테터 (21 G)를 삽입합니다. </li><li> 마우스가 자발적으로 (보통 100 ~ 150 호흡 / 분, 아니 역설적 또는 얕은 호흡) 부드러운 방법으로 호흡 있는지 확인합니다. </li><li> 해부 현미경으로 발생하기 쉬운 위치에 마우스를 놓습니다. </li><li> 기계적으로 설치류 인공 호흡기 사용하여 마우스 환기 (150 호흡 / 분, 7 ml에 / 호흡량을 kg). </li><li> 4 번째와 5 번째 늑골 사이 늑간 공간을 찾기 위해 갈비뼈를 계산합니다. </li><li> B 영역에 걸쳐 멸균 필드 만들기Y는 철저하게 알코올과 포비돈 - 요오드로 닦는 것. 무균 수술 드레이프 적절하게 수술 부위를 커버. </li></ol> 3. 마우스 수술 <ol><li> 피부에 0.25 % bupivacaine을 (200 μL)의 지방 주입 후, 해부 가위를 사용하여 늑간 공간을 통해 가로 피부 절개 (약 1cm 길이)합니다. </li><li> 늑간 근육에 0.25 %의 부피 바카 (200 μL)를 주입 한 후, 미세한 작은 가위를 사용하여 4 번째와 5 번째 갈비뼈 사이의 근육 절개를합니다. </li><li> 완전히 왼쪽 폐를 시각화하기 위해 갈비뼈 사이의 해부 견인기를 삽입합니다. <ol><li> 미세 집게를 사용 왼쪽 폐의 중심의 내장 늑막의 작은 지역 (1 × 1mm 광장)를 쳤어요. </li><li> 출혈 및 공기 누출을 완전히 제어 될 때까지 멸균 면봉을 사용하여 영역에 약간 힘을 주어. </li><li> 피브리노겐 / 트롬빈 (피브린 접착제)의 신선한 혼합물 (단계 1.1.2. 20 &amp; #의 소량을 넣어181; P200 피펫 팁을 사용하여 영역에 걸쳐 L). </li></ol></li><li> 조심스럽게 영역 (그림 1b)를 통해 작은 집게를 사용하여 하나 섬유소 젤 (1.2 단계)를 배치합니다. <ol><li> 젤 잘 폐의 호흡 운동시 지역에 고정되어 있는지 확인합니다. </li></ol></li><li> 도 대규모 공기 누출이나 폐에서 출혈이 있는지 확인합니다. </li><li> 이없는 흡수성 봉합사와의 긴밀한 절개 (근육과 피부 층), 제거 할 수 있습니다. </li><li> 기흉을 방지하기 위해 27 G 바늘과 1 ML의 주사기를 사용하여 흉강을 대기음. </li><li> 기계 환기를 종료합니다. </li></ol> 4. 마우스 복구 <ol><li> 마우스가 자발적으로 부드러운 방법 (일반 100 ~ 150 호흡 / 분, 아니 역설적 또는 얕은 호흡)에서 호흡되어 있는지 확인합니다. </li><li> IP는 1 ㎖ 주입 탈수를 방지하기 위해 0.9 %의 NaCl을 미리 예열. </li><li> 마우스가 순환 온수 패드에 복구 할 수 있습니다. </li><li> endotrache 제거마우스가 안정된 호흡을 확인 후 알 튜브. </li><li> 수술후 진통제로서 3 일간, 멜 록시 캄 (5 ㎎ / ㎏, 피하 주사 (SC)를 주입한다. </li><li> 이 (복부에 출시 할 수 똑바로 유지) 흉골과 의식 때까지 조심스럽게 15 분 간격의 최소 마우스의 움직임을 모니터링합니다. </li><li> 복구 후, 수술없이 생쥐에서 분리 된 새로운 케이지에 마우스를 반환합니다. </li><li> 매일 다음과 같은 감염의 징후 (발적, 부종, 방전), 동물의 기본적인 생물학적 기능 (음식과 물을 섭취, 배뇨, 배변, 체중 증가)뿐만 아니라 임상 증상의 고통에 대한 수술 부위 (경직 감소 운동을) 모니터 수술. </li></ol> 5. 수확 폐 <ol><li> 7~30일 주입 후, 압축 가스의 소스를 통해 CO 2를 사용하여 마우스를 안락사. </li><li> xyphoid 과정의 팁과 흉골 사이에 절개를합니다노치 (중간 흉골)와 호흡 관을 절단과 심장, 폐, 기관지에 모든 연결을 해부하여 조직 학적 및 생화학 적 분석을위한 이식 젤 수확 전체 폐. </li><li> 하룻밤의 OCT 화합물에 포함 된 4 ºC에서 4 % 파라 포름 알데히드 용액으로 폐 이식 젤을 수정, 30 μm의 두께의 직렬 단계 섹션을. </li><li> 조직 학적 (헤 마톡 실린 및 에오신 염색) 및 면역 조직 화학 분석을 수행합니다 (내피 마커 : CD31, 상피 마커 : 아쿠아 포린 (AQP) 5 계면 활성제 단백질 (SP) -B) 공 초점 현미경 22,37,40를 사용하여. </li><li> 3D 이미지 분석 소프트웨어 (37)를 이용하여 폐 내피 세포의 3 차원 영상 및 상피 세포를 형성하는 광학 부 (30 μm의 두께)의 스택을 컴파일한다. </li><li> 이미지 분석 소프트웨어 (46)를 이용하여 새로 형성된 혈관의 투영 면적을 정량화. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

이 문서에서는 성인 마우스를 삶의 폐 표면에 생체 적합 물질을 이식하는 새로운 방법을 소개합니다. 이 시스템을 호스트 폐 유래 혈관이 성공적으로 재료 내부에 효과적으로 요약된다. 이 시스템은 연구자가 내피 세포 사이의 크로스 토크를 탐색 할 수 있습니다, 다른 세포 (예를 들면, 상피 세포, 중간 엽 세포, 면역 세포) 지역의 혈관 신생 50 ~ 53과 치조골 재생 24,54에 필?...

이 프로토콜의 전반적인 목적은 연구자 폐 혈관 및 폐포 개발의 분자 메커니즘을 특성화 할 수 성인 마우스의 폐 표면 상 피브린 겔을 이식하는 방법을 소개하고, 가능한 생체 모방 물질을 개발하기 위해이 지식을 활용하는 것이다 각종 폐 질환을 치료하는 생리 폐 혈관 및 폐포의 형성을 recapitulating. 35 개 이상의 만 명의 미국인이 만성 폐쇄성 폐 질환과 폐 섬유증을 포함한 만성 폐 질환으로 고통 받고 있습니다. 이 환자는 크게 일상 생활 1-3을 손상 등의 호흡 곤란, 흉부 압박감, 잔소리 기침, 피로 오래 지속되는 만성 호흡기 증상을 가지고있다. 이러한 폐 질환에 대한 효과적인 치료법을 개발하는 노력의 큰 금액에도 불구하고, 현재 치료법이 없다; 따라서, 이러한 환자의 삶의 질은 가난하고 경제적이며, 인간의 비용은 안녕하다GH 4-7. 현재 폐 이식은 말기 만성 폐 질환을 가진 환자를 저장할 수있는 유일한 방법입니다. 그러나, 이식 기증자, 높은 비용, 심각한 합병증, 낮은 생존율 8-11의 부족, 이식은 최적의 방법이 아닙니다. 조직 공학 기술 최근의 급속한 발전은 전구 세포 나 유도 만능 줄기 (IPS) 세포 12,13 다양한 종류의 탈세 포화 전체 폐를 다시 채우기에 의해 이식 폐를 생명 공학자 인 연구자를 가능하게했다. 그러나 이러한 생체 공학 폐는 주입 12,14,15 후 몇 시간 동안 호스트 동물의 기능입니다. 폐의 복잡한 구조 및 기능을 재생시키기 바이오 소재를 활용하여도 상당히 성공적이지 못했다. 성인 폐 재생을 제어하는​​ 키 생물학적 과정이 잘 탐험되지 않은 때문일 수 있습니다. 폐에서 혈관 시스템의 형성은 초기의 가장 중요한 이벤트 중 하나 두리입니다NG 개발 및 재생 16-21. 새롭게 산소 만, 영양분과 기관 형성을 위해 요구되는 다양한 세포 구성 요소를 제공 할뿐만 아니라, 주위의 세포에 유익한 22-25 규제 신호를 제공하지 폐 vasculatures 형성. 따라서, 혈관 신생은 성인 폐 24,26,27 회생 폐포에 중요한 역할을한다. 또한, 규제 완화 된 혈관 형성은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) (28), 기관지 폐 이형성증 21-23, 29 및 폐 섬유증과 같은 만성 폐 질환에 기여한다. 따라서, 폐 엔지니어링 또는 만성 폐 질환을 치료하기위한보다 효율적인 전략을 개발하기 위해서는, 특정의 폐 혈관의 근본적인 메커니즘을 이해하는 것이 필요하다. 각 기관은 생리적, 병리 적 상태로 30 ~ 33 사이에 다를 수 있습니다 고유의 기계적, 화학적 특성을 표시합니다. 이 기관 고유의 microenviron사항은 내피 세포의 행동을 조절하고 기관 고유의 방식으로 24,34-36 혈관 네트워크 형성을 조율. 따라서, 폐보다 효율적인 재생을위한 전략을 개발, 폐 혈관 관련 기본 메커니즘은 이해되어야한다. 피하 하이드로 겔 주입 등의 생체 기존의 혈관 신생 분석은 혈관 신생 연구 37-39 광범위하게 사용되었지만, 그 방법은 기관 고유의 혈관 신생을 요점을 되풀이하지 않습니다. 최근에 마우스 폐 탄성 금형에 이식 마트 리겔을 신규 한 방법이 개발되고 성공적 겔 (22)에 혈관과 폐 상피 세포를 보충하는 것으로 나타났다. 이 독특한 접근 방식은 연구자가 생리적, 병리 적 상태에서 혈관 및 비 혈관 폐 세포 사이의 폐 특정 혈관 신생의 메커니즘뿐만 아니라 상호 작용을 탐구 할 수 있습니다. 1) 마트 리겔은 임상 적용에 적합하지 않기 때문에; 2) 예를더 임상 적 접근법으로서, 하이드로 겔 및 호스트 폐 조직 및 3) 폐에 탄성 몰드 잠재적 호흡 동안 폐 기능 및 통증 장애 발생 사이의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 겔을 캐스팅하는데 사용 lastic 금형, 3D 피브린 매트릭스가 혈관 신생 인자를 함유하는 (혈관 내피 성장 인자 (VEGF) / 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)) 탄성 몰드에 캐스팅없이 마우스 폐에 주입되었고, 성공적 호스트 폐 유래의 혈관 신생을 효과적으로 요약했다. 피브린 겔, 트롬빈 절단 된 피브리노겐으로부터 생성 중합체는 피 브릴, 트랩 40,41 생체 내에서 혈관 신생을 촉진하는 등의 bFGF와 VEGF의 혈관 신생 인자와 같은 다양한 공지되어있다. 그 때문에 회생 능력과 생분해 자연 42 피브린 겔 널리 조직 공학 분야에서 사용된다. 이 문서에서는 생활 adul의 폐 표면에 섬유소 젤을 이식하는 새롭고 독특한 접근 방식을 소개합니다t 마우스와 호스트 폐 유래 혈관이 생체 내에서 젤 내부에 효과적으로 요약되어 있음을 보여줍니다. 폐 혈관 신생 관련 공부 연구자 있도록 이러한 방법은, 아마도 폐 질환의 다양한 유형에 대한 새로운 치료 방법의 개발로 이어질 상당히 성공적 성인 폐를 재생하는 노력을 진행한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fibrinogen from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4883</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9549</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse VEGF 164</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>493-MV</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3139-FB</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:177px;">Braintree Scientific INC</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fiber-Optic Light Source</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-35</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20G Elastic catheter</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4251652-02</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">MiniVent Ventilator</td>
			<td style="width:177px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">CGS-8009</td>
			<td>For ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Stemi DV4 Steromicroscope</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-070-515</td>
			<td>For surgey</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Absobable suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>PDP304</td>
			<td>Surgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">553370</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against AQP5</td>
			<td style="width:177px;">Abcam</td>
			<td>AB78486</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against SP-B</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td>AB40876</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

줄기 세포 연구와 생명 공학 기술의 최근 중요한 발전은 재생 및 정형 외과 및 치주 분야에서 간단한 조직에 손상을 복구하는 생체 물질을 활용에 큰 진전을 만들었습니다. 장기 재생의 생물학적 과정을 잘 탐구되지 않은 때문에 구조 및 폐 등과 같은보다 복잡한 3 차원 (3D) 장기의 기능을 재생하려고 시도하는 것은 매우 성공적이지 못 하였다. 이는 혈관 신생은 새로운 혈관의 형성은, 기관 재생에 중요한 역할을한다는 것을 분명 해지고있다. 새로 vasculatures 산소, 영양분 및 장기 재생을 위해 요구되는 다양한 세포 구성 요소를 제공 할뿐만 아니라, 조직 재생에 유익한 로컬 신호를 제공하지 만 형성. 그러므로, 성공적으로 성인의 폐를 재생하기 위해서는 로컬 폐 조직의 재생을 드라이브하는 혈관 신생 폐 특정 미세 환경 요점을 되풀이하는 것이 필요하다. 공동 비록nventional 생체 등의 히드로 겔 (예를 들어, 섬유소 또는 콜라겐 젤 또는 마트 리겔 - Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종 세포에 의해 분비 ECM 단백질 혼합물)이 풍부한 세포 외 기질 (ECM)의 피하 주입으로 혈관 신생 분석, 광범위하게 탐구하기 위해 사용된다 폐에 생체 재료의 소성을 주입하는 방법이 잘 확립되지 않았기 때문에 혈관의 일반적인 메커니즘은, 폐 특정 혈관 신생은 잘 특징되지 않았습니다. 이 프로토콜의 목적은 겔 내부 호스트 폐 유래의 혈관 신생을 성공적 재현부 허용 살아있는 성인 마우스의 폐 표면 상 피브린 겔을 이식하는 독특한 방법을 도입하는 것이다. 이 방법은 폐 별 미세 정상 및 병적 상태 모두에서 혈관 신생과 치조골 재생을 제어하는​​ 메커니즘을 탐구하는 연구자 수 있습니다. 이식 된 생체 재료에 출시 된 이후 인접 리터에 물리적, 화학적 신호를 공급하고웅 조직, 폐 병변 이러한 생체 물질의 주입은 잠재적 폐 질환의 다양한 유형에 대한 새로운 치료 방법을 개발하기 위해 연구를 가능 인접 병든 조직을 정상화 할 수있다.

호스트 폐 유래 혈관 형성은 폐에 주입 된 생체 물질의 내부에 효과적으로 요약되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 피브린 겔 주요 혈관 신생 인자의 VEGF와 bFGF를 보충 (0, 10, 100 ng이다 / mL 씩)로서 살아있는 마우스의 폐 표면 상에 이식 하였다 마트 리겔 (22)를 사용하여보고했다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 이러한 혈관 성장 인자를 포함하는 피브린 겔 (47)을 제작 하?...

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

마우스 폐에 섬유소 젤의 주입은 폐 관련 신생 혈관 연구에

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K 조회수.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

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A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Angiogenesis 연구에 대한 각막 포켓 분석의 마우스 모델

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

연구

의학

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit&#039;s Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

섬유소 혈전의 동종 간엽 줄기 세포의 주입에 의한 토끼의 무릎 관절의 골 연골 결함의 치료

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

허혈성 쥐 폐의 혈관 신생

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

비 침습적 기관 내 삽관 마우스 폐의 병리학 및 생리학을 연구하는

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

나트륨 히알루 론산의 망막 주사 설치류에있는 망막 박리 모델

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

삽관 매개 기관 내 (IMIT) 떨어 뜨림 : 비 침습적, 폐 별 전달 시스템

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

차 종양과 폐 전이을 연구하기 위해 MEF 세포 격리

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

Apical Resection Mouse Model to Study Early Mammalian Heart Regeneration

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring cardiomyocytes lost due to injury and disease. In contrast to the robust cardiac regeneration of certain lower vertebrates, adult mammalian hearts typically show minimal capacity for heart regeneration and repair. However, recent studies have sparked considerable scientific interest with the finding that, between postnatal day 1 to 7 (P1 to P7), the neonatal mouse heart retains significant regenerative potential after apical resection (i.e., surgical amputation and exposure of left ventricular apex). One major controversy over this finding might be due to the diverse surgery-related procedures used in efforts to replicate or expand upon this important finding. These instructions dynamically present the materials and methodology for apical resection in a mouse model. The salient steps of this rodent survival surgery involve hypothermia anesthesia, thoracotomy, surgical amputation of heart ventricular apex, and suture and recovery of mice. The approach described could expand the application of the apical resection mouse model for cardiovascular research.

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

치근단 절제술 마우스 모델은 초기 포유류의 심장 재생을 연구하는

Cardiovascular disease plagues the whole world due to intensive lifestyle changes. Heart regeneration holds great promise for repairing and restoring ...

Methods Article

마우스 폐에 섬유소 젤의 주입은 폐 관련 신생 혈관 연구에