Name: a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation
Uploaded: 2018-03-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation at JoVE.com

저자는 친절 하 게 제공 하는 시 약 및 마우스에 대 한 박사 Minghan 통 및 미 카토를 감사합니다. 우리는 유용한 토론 Zou 실험실의 구성원 감사. 이 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 973에서 9 사람들의 병원, 상해 Jiao 집게 대학의 학부의 임상 연구 프로그램은 중국 교육부의 과학 및 기술 (대부분) [2014CB964704, 2015CB964503]에서 프로그램. 세포 생물학 및 화학 생물학에 대 한 핵심 시설, 분자 세포 과학, 상하이 연구소 생화학 및 세포 생물학, 과학의 중국 아카데미의 우수성에 대 한 CAS 센터에 대 한 핵심 시설의 도움 주셔서 감사.

동물에 관련 된 모든 절차 실험실 동물 케어 (APLAC)에 스탠포드 행정 패널에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행한 및 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 연구소 생화학 및 세포의 승인 생물학입니다.
1입니다. 준비
<ol><li>Osteoclast 특정 랩 터 삭제 마우스 (랩 터플로리다/플로리다; 생성 Ctsk-cre, 향후 랩Ctsk) Ctsk-cre 쥐와 랩 터플로리다/플로리다 쥐를 교배 하 여. 랩 터플로리다/플로리다 마우스를 사용 하 여이 연구에서 WT 컨트롤.</li>
	<li>고립 된 뼈를 유지 하는 얼음 용기가 있다.</li>
	<li>
문화 매체를 준비 합니다.
	<ol>
<li>최소 필수 중간 알파 (α-MEM) 1 x 글루타민, 페니실린-스와 10% 태아 종 아리 혈 청을 보완 하 여 α-MEM 문화 매체를 준비 합니다.</li>
		<li>골 대 식 세포 유도 매체 20 ng/mL에서 α-MEM 매체와 M-CSF의 50 mL의 구성 된 준비.</li>
		<li>Osteoclast 유도 매체 구성 된 M-CSF RANKL 20 ng/mL에서 각각, α-MEM 매체의 50 ml에서를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트랩 얼룩이 지기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
	<ol>
<li>아세톤, 시트르산 솔루션 및 37% (vol/vol) 포름알데히드 용액의 0.8 mL 2.5 mL의 6.5 mL의 구성 수정 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>트랩 솔루션 얼룩을 준비 합니다.<ol>
<li>37 ° c.에 prewarm 이온된 수</li>
			<li>1.5 mL microtube에 빠른 가닛 GBC 기본 솔루션의 100 µ L 및 나트륨 아 질산염 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 혼합 30 미 허가 부드러운 반전 하 여 2 분 동안 서 서 혼합물.</li>
			<li>37 ° c 이온된 물 9 mL prewarm 단계 1.4.2.2, naphthol AS 비 인산 염 솔루션, 아세테이트 솔루션의 400 µ L 및 주석산 솔루션의 200 µ L의 100 µ L에서에서 빨리 가닛 diazotized GBC 기본 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>37 ° c.에 물 욕조에 혼합 솔루션 얼룩 트랩을 유지</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 매체의 트랩 활동 정량화 하기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
	<ol>
<li>주석산 버퍼 (50 mL) 준비: 0.33 M L tartaric 산 성, 염기 0.33 M 나트륨 주석산의 48 mL의 2 mL 탈수. 4.9에 pH 값을 조정 합니다.</li>
		<li>4-Nitrophenyl 인산 disodium (pNPP) 버퍼 (200 mL) 준비: 글리신의 1.502 g, MgCl2의 41 밀리 그램, ZnCl2, 27.2 mg 및 이온된 물 180 mL. 3 M NaOH와 10.4 pH 값 및 이온 물 200 mL을 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>PNPP 버퍼 인산 가수분해 효소 기질 (한 96 잘 접시)에 대 한 준비: 인산 가수분해 효소 기질과 단계 1.5.2의 pNPP 버퍼의 175 µ L의 49.37 mg.</li>
		<li>기판 버퍼 (9 mL/96 잘 접시) 준비: 이온된 수, 아세테이트 솔루션의 360 μ, 주석산 버퍼의 2.4 mL 6.24 mL. 소용돌이 의해 혼합 하 고 사용 하기 전에 37 ° C에서 예 열.</li>
		<li>기판 혼합물 및 10에 대 한 소용돌이를 데워 기판 buffer(1.5.4)의 9 ml에 추가할 인산 가수분해 효소 substrate(1.5.3)와 pNPP 버퍼의 90 μ s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. (주-1) 해 부
<ol><li>CO2 3 1 달 오래 된 여성 WT 및 랩Ctsk 마우스를 별도로 안락사. 훈련 된 직원에 의해 적절 한 장비와 CO2 흡입을 수행 합니다.</li>
	<li>6 마우스의 세균 오염을 방지 하기 다음 부정사 위치에 해 부 보드에 장소를 5 분 동안 75% 에탄올 (vol/vol) 100 mL를 비 커에 담가. 경골의 원심에 세로로 절 개를 확인 하 고 안과 위 뒷 다리를 따라 피부를 해 부.</li>
	<li>고관절의 관절 인 대가 위로 잘라 고 트렁크에서 뒷 다리 사지를 탈 구.</li>
	<li>무릎 관절의 관절 인 대를 절단 하 고 경골 및 대 퇴 골 무릎 관절에서 신중 하 게 끊을. 부드럽게가 위로 부드러운 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>얼음에 α-MEM의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트의 각 음에 한 마우스에 하나의 유전자의 모든 뼈를 배치 합니다. 참고: 세포 생존 능력을 유지 하는 뼈는 미만 1 시간에 대 한 이러한 조건에서 유지 되어야 한다.</li>
</ol>3입니다. 절연 (주-1)
<ol><li>Α-MEM 매체 (3 mL)와 75% 에탄올 (3 mL) 6 잘 플레이트 한 우물 및 다른 5 웰 스 작성.</li>
	<li>5 번 10 α-MEM 매체와 15 s 및 세척 뼈에 대 한 에탄올 세척에 한 유전자 형의 모든 뼈를 넣어 s 각 시간.</li>
	<li>시저와 epiphyses에서 잘라내어 구멍 및 플러시 골 밖으로 50 mL 원심 분리기 관으로 α-MEM 매체와 0.45 m m 주사기 바늘을 삽입.</li>
	<li>뼈의 다른 쪽 끝에서 동일한 방법을 사용 하 여 뼈 구멍을 플러시. 뼈는 창백한 될 때까지 철저 하 게 뼈 구멍을 씻어 두 번 이상 반복 합니다.</li>
	<li>800 x g와 4 ° C 5 분 Aspirate는 상쾌한 셀 펠 렛을 얻기 위해 골 원심</li>
	<li>원심 분리기 튜브와 골 수를 resuspend를 부드럽게 피 펫에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL를 추가 합니다. 원심 분리기 튜브 8 분 붉은 혈액 세포를 lyse 얼음에 계속.</li>
	<li>세포 세포의 용 해를 막으려고 원심 분리기 튜브에 α-MEM 매체의 6 mL를 추가 합니다. G와 10 분 동안 4 ° C x 500에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>Α-MEM 문화 매체의 3 ml에서 resuspend 고 셀 6 잘 플레이트 (일반적으로 하나의 마우스 잘 당) 합니다.</li>
	<li>5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>4입니다. 도금 (0 일)
<ol><li>15 mL 원심 분리기 튜브 다음날 아침 첨부 되지 않은 세포를 수집 하는 상쾌한 전송.</li>
	<li>G와 5 분 동안 4 ° C x 800 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>Α-MEM 문화 매체의 4 mL에 resuspend.</li>
	<li>셀 솔루션의 20 µ L 고 20 µ L Trypan 파랑의 혼합. 세 실로 혼합물의 10 µ L을 추가 하 고 솔루션의 mL 당 셀 수를 얻을.</li>
	<li>500, 000 셀/mL의 셀 솔루션을 얻기 위해 α-MEM 문화 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>추가 500 µ L 골 대 식 세포 유도 매체의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>추가 500 µ L 셀 솔루션의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>3 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어.</li>
</ol>5. 차별화 (3-7 일)
<ol><li>도금, 후 3 일 96 잘 접시의 각 우물에서 50 µ L 매체를 수집 하 고-20 ° C에서 동결 후 잔여 중간 발음.</li>
	<li>추가 1 mL 및 100 µ L osteoclast 유도 매체는 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>2 일 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 하 고 잔여 중간 발음.</li>
	<li>각 우물에 osteoclast 유도 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>1 일 37 ° C에서 품 어. 참고:이 시간 포인트에서 큰, multinucleated osteoclasts 보여야 한다 거꾸로 현미경 (그림 2A).</li>
	<li>Osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 유도 매체를 변경 하 고 osteoclasts 볼 수 있습니다 때까지 매일 관찰.</li>
	<li>Osteoclasts 형성 후 96 잘 접시의 각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 합니다.</li>
</ol>6. 주석산 얼룩 저항 하는 산 성 인산 가수분해 효소 (함정)
참고: 성숙한 osteoclasts 생체 외에서 문화 (4 단계)의 6-7 일 후 존재할 수 있습니다.
<ol><li>중간 발음 하 고 부드럽게 1 x PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>30에 대 한 수정 프로그램 솔루션의 100 µ L 96 잘 접시의 각 잘 셀 수정 실 온에서 s.</li>
	<li>고정, 후 수정 솔루션을 발음 하 고 37 ° c.에 prewarmed 이온된 수 3 번 부드럽게 씻어 이온된 수 발음</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 트랩 얼룩의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 30 분 한 빛에서 방패는 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>얼룩, 후 발음 트랩 얼룩 하 고 부드럽게 이온된 물으로 3 회 세척.</li>
	<li>이미지 osteoclasts 40 X 확대는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여.</li>
</ol>7. 트랩 활동 부 량의 문화 매체
<ol><li>표면에 뜨는 30 µ L 문화 단계 5.1, 5.4, 5.8; 96 잘 접시의 각 우물에서 수집 비 경작 osteoclast 유도 매체의 30 µ L를 사용 하 여 부정적인 제어. 샘플을 새로운 96 잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 기판 mixture(1.5.5)의 90 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>1 h와 빛 으로부터 방패에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 3 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>405의 파장에서 theabsorbance 측정 nm.</li>
</ol>8. 서 부 럽
참고: 6-7 일 후 24-잘 접시에 생체 외에서 문화, 성숙한 osteoclasts 표시 되어야 합니다.
<ol><li>매체 발음</li>
	<li>부드럽게 씻어 미리 PBS 3 시간 x 1 냉각.</li>
	<li>PBS 발음</li>
	<li>SDS 세포의 용 해 버퍼 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 105 ° C에서 열 lysates 및 12000 × g와 4 ° C에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 단백질을 포함 하는 supernatants 수집 합니다.</li>
	<li>Lysates 10 %SDS 페이지11 30 µ g의 단백질을 포함 하 고 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 전송 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 5% 탈지 우유와 함께 막 차단 합니다.</li>
	<li>반대로 랩 터, 안티-P-S6, S6 안티, 안티-β-말라 4 ° C에서 5% 탈지 우유에 1:1,000 희석 하룻밤에 막 품 어.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 Tris 버퍼 염 트윈 20 (TBST)와 함께 막 씻으십시오.</li>
	<li>단계 8.9 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-실 온에서 1 h 5% 탈지 우유에 1:5,000 희석에 반대로 마우스 또는 토끼 IgG 항 체를 활용.</li>
	<li>실 온에서 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막을 씻어.</li>
	<li>Chemiluminescent 탐지에 대 한 세포 막에 서쪽 chemiluminescent HRP 기질을 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 초과 기판 배수와 x 선 필름에도 말을 폭로.</li>
</ol>

<ol>
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모든 저자 들은 관심의 없습니다 충돌 상태.

Osteoclastogenic 분석 결과 격리 하 고 문화 osteoclasts 생체 외에서12,13가장 널리 사용 되는 방법 이다. 동안 여러 RANKL 기반 osteoclast inductions 설명된13,,1415, 현재 연구는 이전 방법에 따라 일부 수정 프로토콜을 설명 합니다.
이전 연구에서 BMMs는 절연<sup class="xref...

뼈는 끊임없이 변화 장기 이며 osteoblasts 그리고 생활 내내 osteoclasts에 의해 개조. Osteoclasts 광물 화 된 매트릭스 재흡수에 대 한 책임은 osteoblasts 합성 하 고 새로운 뼈 매트릭스1분 비. 뼈 재흡수와 골 형성 사이 균형은 뼈의 유지 보수를 포함 하는 뼈 건강에 중요 한 대량 및 자극과 상해에 대 한 응답. 이 균형을 방해 하는 경우 골다공증 및 치 주 질환을 포함 한 일련의 뼈 대사 질환 발생할 수 있습니다. 이 질병에서 뼈 질량 손해 osteoclastic 뼈 재흡수 osteoblasts2,3의 능력을 형성 하는 뼈를 초과 합니다. 따라서, 골다공증 같은 골격 질환을 치료 하 제약 목표를 개발 하기 위하여 그것은 생성 및 osteoclasts4의 생물학을 이해 하는 중요 한.
Osteoclasts 독특한 거 대 한 multinucleated 세포 나 뼈 표면 근처에 위치 하 고 monocyte/대 식 세포 가족1에 속한다. Ibbotson K. J. 외. 1, 25-dihydroxy-비타민 D35를 포함 하는 매체와 osteoclast 같은 세포에서 생체 외에서 생성 하는 방법을 보고. Osteoclast 형성의 필수적인 요인으로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 및 핵 요인-κ B ligand (RANKL)에 대 한 수용 체 활성의 식별 극적으로 osteoclastogenesis 체 외 의 효율성 증가 1 , 6 , 7. 수 문화 osteoclasts에서 생체 외에서 세대의 우리의 이해와 osteoclasts의 규제 개선 했다.
2 구조적 및 기능적으로 뚜렷한 단지, 즉 mTORC1 및 mTORC28,9rapamycin (mTOR) 함수의 포유류/기계적 대상. 두 다 단백질 복합물은 다릅니다 서로 그들의 서로 다른 구성 요소와 다운스트림 기판. mTORC1 mTORC2 포함 mTOR (Rictor)9의 rapamycin을 구분 하지 않는 동반자 mTOR (랩 터)의 독특한 규정 관련 단백질을 포함 합니다. mTORC1 통합 하 고 통제 세포 성장, 증식 및 분화에 중요 한 신호를 전송할 수 있습니다. 최근에, 우리는 mTORC1 중요 한 역할 catabolic 뼈 재흡수의 네트워크에서 랩 터 osteoclasts10에서 mTORC1을 비활성화에 삭제에 의해 입증. 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 야생-타입 (WT) 및 랩Ctsk 마우스의 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 osteoclasts를 생성 하 고 mTORC1 비활성화 osteoclast에의 영향을 공부 RANKL 기반 osteoclastogenic 메서드 사용 되었다 형성입니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Raptor&lt;sup&gt;fl/fl&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>013188</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Ctsk-cre&lt;/em&gt; mice</td><td></td><td></td><td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-MEM</td><td>Corning</td><td>10-022-CVR</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Gibico</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Gibico</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fetal calf serum</td><td>BioInd</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse M-CSF protein</td><td>R&amp;amp;D</td><td>Q3U4F9</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse RANKL protein</td><td>R&amp;amp;D</td><td>Q3TWY5</td><td></td></tr><tr><td>RBC lysis buffer</td><td>Beyotime</td><td>C3702</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302643</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Citrate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>915</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>387A-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Fast Garnet GBC Base solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3872</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Nitrite Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>914</td><td></td></tr><tr><td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3871</td><td></td></tr><tr><td>Acetate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3863</td><td></td></tr><tr><td>Tartrate solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate-buffered saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CVR</td><td></td></tr><tr><td>L-tartaric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251380</td><td></td></tr><tr><td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>s4797</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatase substrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4744</td><td></td></tr><tr><td>anti-Raptor</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2280</td><td></td></tr><tr><td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2317</td><td></td></tr><tr><td>anti-ribosomal protein S6</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>2211</td><td></td></tr><tr><td>anti-&amp;beta;-actin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-130300</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde</td><td>Xilong scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td><td>Millipore</td><td>00000367MSDS</td><td></td></tr><tr><td>IX71</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Envision</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45-mm Syringe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scissor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mosquito forcep</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

Osteoclasts 뼈 resorbing 고유는 골의 monocyte/대 식 세포 계보에서 차별화 하는 셀. Osteoclasts의 장애는 뼈 대사 질환, 골다공증 등의 시리즈에 발생할 수 있습니다. 병 적인 뼈 질량 손실의 방지를 위한 제약 목표를 개발 하는 선구자에서 osteoclasts 분화 메커니즘 이해 되어야 한다. 격리 하 고 많은 osteoclasts에서 생체 외에서 문화 능력이 osteoclast 차별화에 특정 한 유전자의 역할을 결정 하기 위해 중요 합니다. Osteoclasts에 복잡 한 1 (TORC1) rapamycin의 포유류/기계적 대상의 비활성화 수 osteoclast 수 감소와 증가 뼈 질량; 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 mTORC1 비활성화 osteoclast 형성에의 영향을 공부 하 고 분리 하 고 마우스 골 수에서 osteoclasts 문화 RANKL 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 일반적으로 1 주일 이내 거 대 한 osteoclasts의 많은 수에서 결과. 랩 터 의 삭제 osteoclast 형성 장애 고 분 비 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소, 그 mTORC1을 나타내는 osteoclast 형성에 대 한 중요 한의 활동을 감소.

현재 프로토콜을 사용 하 여, 많은 수의 거 대 한 osteoclasts에 볼 수 있었다 주 6; 거 대 한 osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 차별화의 한 더 날 수 있습니다 (그림 1) 필요. 성공적인 osteoclast 대형 함정 얼룩 (그림 2A)에 의해 확인 됐다. Osteoclasts 이상의 3 핵으로 거 대 한 와인 레드/보라색 셀을 했다. 250 개 이상의 osteoclasts WT BMMs (<str...

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A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

a-rankl-based-osteoclast-culture-assay-mouse-bone-marrow-to

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.8K 조회수.  National Clinical Research Center of Stomatology. 이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

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Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We developed an in vitro fully human preclinical model of a co-culture of breast cancer cells and monocytes undergoing differentiation towards osteoclasts. We optimized a model of osteoclastogenesis starting from a sample of peripheral blood collected from healthy donors. Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were first separated by density gradient centrifugation, seeded at a high density and induced to differentiate by adding two growth factors (GFs): receptor activator of nuclear factor-&#954;B ligand (RANKL) and macrophage colony-stimulating factor (MCSF). The cells were left in culture for 14 days and then fixed and analyzed by downstream analysis. In osteolytic bone metastases, one of the effects of cancer cell arrival in bone is the induction of osteoclastogenesis. We thus challenged our model with co-cultures of breast cancer cells to study the differentiation power of cancer cells with respect to GFs. A straightforward way of studying cancer cell-osteoclast interaction is to perform indirect co-cultures based on the use of conditioned medium collected from breast cancer cell cultures and mixed with fresh medium. This mixture is then used to induce osteoclast differentiation. We also optimized a method of direct co-culture in which cancer cells and monocytes undergoing differentiation share the medium and exchange secreted factors. This is a significant improvement over the original indirect co-culture method as researchers can observe the reciprocal interactions of the two cell types and perform downstream analyses for both cancer cells and osteoclasts. This method enables us to study the effect of drugs on the metastatic bone microenvironment and to seed cell lines other than those derived from breast cancer. The model can also be used to study other diseases such as osteoporosis or other bone conditions.

This protocol describes development of an in vitro human preclinical model of osteoclastogenesis from peripheral blood monocytes cultured with breast cancer cell lines to mimic the cancer cell-osteoclast interaction. The model could be used to further our understanding of bone metastasis formation and improve therapeutic options.

말 초 혈액 Monocytes 유 방 암 세포 라인 공동 경작에서 Osteoclastogenesis의 인간의 전 임상 모델의 개발

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

연구

암 연구학

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

발생학

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within the bone marrow cavity alongside hematopoietic stem cells (HSCs), which can give rise to red blood cells, immune progenitors, and osteoclasts. Thus, extractions of cell populations from the bone marrow results in a very heterogeneous mix of various cell populations, which can present challenges in experimental design and confound data interpretation. Several isolation and culture techniques have been developed in laboratories in order to obtain more or less homogeneous populations of BMSCs and HSCs invitro. Here, we present two methods for isolation of BMSCs and HSCs from mouse long bones: one method that yields a mixed population of BMSCs and HSCs and one method that attempts to separate the two cell populations based on adherence. Both methods provide cells suitable for osteogenic and adipogenic differentiation experiments as well as functional assays.

In this article, we present methods to isolate and differentiate bone marrow stromal cells and hematopoietic stem cells from mouse long bones. Two different protocols are presented yielding different cell populations suitable for expansion and differentiation into osteoblasts, adipocytes, and osteoclasts.

절연, 문화, 및 골 수 기질 세포와 생쥐에서 Osteoclast 창시자의 차별화

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

A Novel in vivo Gene Transfer Technique and in vitro Cell Based Assays for the Study of Bone Loss in Musculoskeletal Disorders

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

소설<em&gt; 생체</em&gt; 유전자 전달 기술과<em&gt; 시험관</em근골격계 질환의 뼈 손실의 연구를위한&gt; 셀 기반 분석 실험

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone ...

의학

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by osteoclasts in response to different stimuli. Osteoclast precursors differentiate into multinuclear osteoclasts in response to macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL). Under pathologic conditions, the cytokine profile is different and involves a mixture of inflammatory cytokines. Tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) is one of the most important cytokines as it is found in large amounts in areas involved with inflammatory osteolysis. The purpose of this protocol is to provide a method by which murine bone marrow is isolated to generate osteoclasts through induction with M-CSF and either RANKL or TNF-&#945; which will be subsequently inhibited by increasing doses of anti-c-fms antibody, the receptor for M-CSF. This experiment highlights the therapeutic value of anti-c-fms antibody in diseases of inflammatory bone resorption.

This protocol includes dissection of murine long bones and bone marrow isolation, to generate bone marrow macrophages and produce osteoclasts using macrophage colony stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor Kappa-B ligand (RANKL) or tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) and their arrest by anti-c-fms antibody, M-CSF receptor.

Osteoclast 형성과 생체 외에서 Osteoclast 선구자의 확산에 안티-c-fms 항 체의 효과

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

면역학 및 감염병학

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused by increased differentiation and activation of OCs, so the inhibition of this pathobiology is a key therapeutic principle.Two key factors drive the differentiation of OCs from myeloid precursors: macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) and receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL). Human circulating CD14+ monocytes have long been known to differentiate into OCs in vitro. However, the exposure time and the concentration of RANKL influence the differentiation efficiency. Indeed, protocols for the generation of human OCs in vitro have been described, but they often result in a poor and lengthy differentiation process. Herein, a robust and standardized protocol for generating functionally active mature human OCs in a timely manner is provided. CD14+ monocytes are enriched from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and primed with M-CSF to upregulate RANK. Subsequent exposure to RANKL generates OCs in a dose- and time-dependent manner. OCs are identified and quantified by staining with tartrate acid-resistant phosphatase (TRAP) and light microscopy analysis. Immunofluorescence staining of nuclei and F-actin is used to identify functionally active OCs. In addition, OSCAR+CD14&#8722; mature OCs are further enriched via flow cytometry cell sorting, and OC functionality quantified by mineral (or dentine/bone) resorption assays and actin ring formation. Finally, a known OC inhibitor, rotenone, is used on mature OCs, demonstrating that adenosine triphosphate (ATP) production is essential for actin ring integrity and OC function. In conclusion, a robust assay for differentiating high numbers of OCs is established in this work, which in combination with actin ring staining and an ATP assay&#160;provides a useful in vitro model to evaluate OC function and to screen for novel therapeutic compounds that can modulate the differentiation process.

Differentiation of Functional Osteoclasts from Human Peripheral Blood CD14+ Monocytes

Osteoclasts are key bone-resorbing cells in the body. This protocol describes a reliable method for the in vitro differentiation of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. This method can be used as an important tool to further understand osteoclast biology in homeostasis and in diseases.

기능성 파골세포와 인간 말초 혈액 CD14+ 단핵구의 분화

Osteoclasts (OCs) are bone-resorbing cells that play a pivotal role in skeletal development and adult bone remodeling. Several bone disorders are caused ...

Application of Retinoic Acid to Obtain Osteocytes Cultures from Primary Mouse Osteoblasts

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell numbers. Therefore, the most widely used cellular system is the osteocyte-like MLO-Y4 cell line.
The method here described refers to the use of retinoic acid to generate a homogeneous population of ramified cells with morphological and molecular osteocyte features.
After isolation of osteoblasts from mouse calvaria, all-trans retinoic acid (ATRA) is added to cell medium, and cell monitoring is conducted daily under an inverted microscope. First morphological changes are detectable after 2 days of treatment and differentiation is generally complete in 5 days, with progressive development of dendrites, loss of the ability to produce extracellular matrix, down-regulation of osteoblast markers and up-regulation of osteocyte-specific molecules.
Daily cell monitoring is needed because of the inherent variability of primary cells, and the protocol can be adapted with minimal variation to cells obtained from different mouse strains and applied to transgenic models. 
The method is easy to perform and does not require special instrumentation, it is highly reproducible, and rapidly generates a mature osteocyte population in complete absence of extracellular matrix, allowing the use of these cells for unlimited biological applications.

Treatment of primary mouse osteoblasts with retinoic acid produces a homogeneous population of ramified cells bearing morphological and molecular features of osteocytes. The method overcomes the difficulty of obtaining and maintaining primary osteocytes in culture, and can be advantageous to study cells derived from transgenic models.&#160;

기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

The need for osteocyte cultures is well known to the community of bone researchers; isolation of primary osteocytes is difficult and produces low cell ...

생물학

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

마우스 골수에서 파골 세포의 유도

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases (e.g., osteoporosis and bone cancer) and are therefore important objects of research. In vitro, their activity can be analyzed by the formation of resorption pits. In this protocol, we describe a simple pit assay method using calcium phosphate (CaP) coated cell culture plates, which can be easily visualized and quantified. Osteoclast precursors derived from human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were cultured on the coated plates in the presence of osteoclastogenic stimuli. After 9 days of incubation, osteoclasts were fixed and stained for fluorescence imaging while the CaP coating was counterstained by calcein. To quantify the resorbed area, the CaP coating on plates was stained with 5% AgNO3 and visualized by brightfield imaging. The resorption pit area was quantified using ImageJ.

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Here, we present a simple and effective assay procedure for resorption pit assays using calcium phosphate coated cell culture plates.

시험관 내에서 파골세포 재흡수를 시각화하고 정량화하는 간단한 구덩이 분석 프로토콜

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

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