저자는 친절 하 게 제공 하는 시 약 및 마우스에 대 한 박사 Minghan 통 및 미 카토를 감사합니다. 우리는 유용한 토론 Zou 실험실의 구성원 감사. 이 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다 973에서 9 사람들의 병원, 상해 Jiao 집게 대학의 학부의 임상 연구 프로그램은 중국 교육부의 과학 및 기술 (대부분) [2014CB964704, 2015CB964503]에서 프로그램. 세포 생물학 및 화학 생물학에 대 한 핵심 시설, 분자 세포 과학, 상하이 연구소 생화학 및 세포 생물학, 과학의 중국 아카데미의 우수성에 대 한 CAS 센터에 대 한 핵심 시설의 도움 주셔서 감사.

동물에 관련 된 모든 절차 실험실 동물 케어 (APLAC)에 스탠포드 행정 패널에 의해 승인 하는 프로토콜에 따라 수행한 및 동물 관리 및 사용 위원회 상하이 연구소 생화학 및 세포의 승인 생물학입니다.
1입니다. 준비
<ol><li>Osteoclast 특정 랩 터 삭제 마우스 (랩 터플로리다/플로리다; 생성 Ctsk-cre, 향후 랩Ctsk) Ctsk-cre 쥐와 랩 터플로리다/플로리다 쥐를 교배 하 여. 랩 터플로리다/플로리다 마우스를 사용 하 여이 연구에서 WT 컨트롤.</li>
	<li>고립 된 뼈를 유지 하는 얼음 용기가 있다.</li>
	<li>
문화 매체를 준비 합니다.
	<ol>
<li>최소 필수 중간 알파 (α-MEM) 1 x 글루타민, 페니실린-스와 10% 태아 종 아리 혈 청을 보완 하 여 α-MEM 문화 매체를 준비 합니다.</li>
		<li>골 대 식 세포 유도 매체 20 ng/mL에서 α-MEM 매체와 M-CSF의 50 mL의 구성 된 준비.</li>
		<li>Osteoclast 유도 매체 구성 된 M-CSF RANKL 20 ng/mL에서 각각, α-MEM 매체의 50 ml에서를 준비 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
트랩 얼룩이 지기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
	<ol>
<li>아세톤, 시트르산 솔루션 및 37% (vol/vol) 포름알데히드 용액의 0.8 mL 2.5 mL의 6.5 mL의 구성 수정 솔루션을 준비 합니다.</li>
		<li>트랩 솔루션 얼룩을 준비 합니다.<ol>
<li>37 ° c.에 prewarm 이온된 수</li>
			<li>1.5 mL microtube에 빠른 가닛 GBC 기본 솔루션의 100 µ L 및 나트륨 아 질산염 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 혼합 30 미 허가 부드러운 반전 하 여 2 분 동안 서 서 혼합물.</li>
			<li>37 ° c 이온된 물 9 mL prewarm 단계 1.4.2.2, naphthol AS 비 인산 염 솔루션, 아세테이트 솔루션의 400 µ L 및 주석산 솔루션의 200 µ L의 100 µ L에서에서 빨리 가닛 diazotized GBC 기본 솔루션의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>37 ° c.에 물 욕조에 혼합 솔루션 얼룩 트랩을 유지</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 매체의 트랩 활동 정량화 하기 전에 다음 버퍼를 준비 합니다.
	<ol>
<li>주석산 버퍼 (50 mL) 준비: 0.33 M L tartaric 산 성, 염기 0.33 M 나트륨 주석산의 48 mL의 2 mL 탈수. 4.9에 pH 값을 조정 합니다.</li>
		<li>4-Nitrophenyl 인산 disodium (pNPP) 버퍼 (200 mL) 준비: 글리신의 1.502 g, MgCl2의 41 밀리 그램, ZnCl2, 27.2 mg 및 이온된 물 180 mL. 3 M NaOH와 10.4 pH 값 및 이온 물 200 mL을 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>PNPP 버퍼 인산 가수분해 효소 기질 (한 96 잘 접시)에 대 한 준비: 인산 가수분해 효소 기질과 단계 1.5.2의 pNPP 버퍼의 175 µ L의 49.37 mg.</li>
		<li>기판 버퍼 (9 mL/96 잘 접시) 준비: 이온된 수, 아세테이트 솔루션의 360 μ, 주석산 버퍼의 2.4 mL 6.24 mL. 소용돌이 의해 혼합 하 고 사용 하기 전에 37 ° C에서 예 열.</li>
		<li>기판 혼합물 및 10에 대 한 소용돌이를 데워 기판 buffer(1.5.4)의 9 ml에 추가할 인산 가수분해 효소 substrate(1.5.3)와 pNPP 버퍼의 90 μ s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. (주-1) 해 부
<ol><li>CO2 3 1 달 오래 된 여성 WT 및 랩Ctsk 마우스를 별도로 안락사. 훈련 된 직원에 의해 적절 한 장비와 CO2 흡입을 수행 합니다.</li>
	<li>6 마우스의 세균 오염을 방지 하기 다음 부정사 위치에 해 부 보드에 장소를 5 분 동안 75% 에탄올 (vol/vol) 100 mL를 비 커에 담가. 경골의 원심에 세로로 절 개를 확인 하 고 안과 위 뒷 다리를 따라 피부를 해 부.</li>
	<li>고관절의 관절 인 대가 위로 잘라 고 트렁크에서 뒷 다리 사지를 탈 구.</li>
	<li>무릎 관절의 관절 인 대를 절단 하 고 경골 및 대 퇴 골 무릎 관절에서 신중 하 게 끊을. 부드럽게가 위로 부드러운 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>얼음에 α-MEM의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트의 각 음에 한 마우스에 하나의 유전자의 모든 뼈를 배치 합니다. 참고: 세포 생존 능력을 유지 하는 뼈는 미만 1 시간에 대 한 이러한 조건에서 유지 되어야 한다.</li>
</ol>3입니다. 절연 (주-1)
<ol><li>Α-MEM 매체 (3 mL)와 75% 에탄올 (3 mL) 6 잘 플레이트 한 우물 및 다른 5 웰 스 작성.</li>
	<li>5 번 10 α-MEM 매체와 15 s 및 세척 뼈에 대 한 에탄올 세척에 한 유전자 형의 모든 뼈를 넣어 s 각 시간.</li>
	<li>시저와 epiphyses에서 잘라내어 구멍 및 플러시 골 밖으로 50 mL 원심 분리기 관으로 α-MEM 매체와 0.45 m m 주사기 바늘을 삽입.</li>
	<li>뼈의 다른 쪽 끝에서 동일한 방법을 사용 하 여 뼈 구멍을 플러시. 뼈는 창백한 될 때까지 철저 하 게 뼈 구멍을 씻어 두 번 이상 반복 합니다.</li>
	<li>800 x g와 4 ° C 5 분 Aspirate는 상쾌한 셀 펠 렛을 얻기 위해 골 원심</li>
	<li>원심 분리기 튜브와 골 수를 resuspend를 부드럽게 피 펫에 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 버퍼의 3 mL를 추가 합니다. 원심 분리기 튜브 8 분 붉은 혈액 세포를 lyse 얼음에 계속.</li>
	<li>세포 세포의 용 해를 막으려고 원심 분리기 튜브에 α-MEM 매체의 6 mL를 추가 합니다. G와 10 분 동안 4 ° C x 500에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>Α-MEM 문화 매체의 3 ml에서 resuspend 고 셀 6 잘 플레이트 (일반적으로 하나의 마우스 잘 당) 합니다.</li>
	<li>5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
</ol>4입니다. 도금 (0 일)
<ol><li>15 mL 원심 분리기 튜브 다음날 아침 첨부 되지 않은 세포를 수집 하는 상쾌한 전송.</li>
	<li>G와 5 분 동안 4 ° C x 800 centrifuge 고는 상쾌한 발음.</li>
	<li>Α-MEM 문화 매체의 4 mL에 resuspend.</li>
	<li>셀 솔루션의 20 µ L 고 20 µ L Trypan 파랑의 혼합. 세 실로 혼합물의 10 µ L을 추가 하 고 솔루션의 mL 당 셀 수를 얻을.</li>
	<li>500, 000 셀/mL의 셀 솔루션을 얻기 위해 α-MEM 문화 매체의 적절 한 볼륨을 추가 합니다.</li>
	<li>추가 500 µ L 골 대 식 세포 유도 매체의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>추가 500 µ L 셀 솔루션의 50 µ L 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>3 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 품 어.</li>
</ol>5. 차별화 (3-7 일)
<ol><li>도금, 후 3 일 96 잘 접시의 각 우물에서 50 µ L 매체를 수집 하 고-20 ° C에서 동결 후 잔여 중간 발음.</li>
	<li>추가 1 mL 및 100 µ L osteoclast 유도 매체는 24-잘 접시와 96 잘 접시의 각 음에 각각.</li>
	<li>2 일 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 하 고 잔여 중간 발음.</li>
	<li>각 우물에 osteoclast 유도 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>1 일 37 ° C에서 품 어. 참고:이 시간 포인트에서 큰, multinucleated osteoclasts 보여야 한다 거꾸로 현미경 (그림 2A).</li>
	<li>Osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 유도 매체를 변경 하 고 osteoclasts 볼 수 있습니다 때까지 매일 관찰.</li>
	<li>Osteoclasts 형성 후 96 잘 접시의 각 우물에서 매체의 50 µ L를 수집 합니다.</li>
</ol>6. 주석산 얼룩 저항 하는 산 성 인산 가수분해 효소 (함정)
참고: 성숙한 osteoclasts 생체 외에서 문화 (4 단계)의 6-7 일 후 존재할 수 있습니다.
<ol><li>중간 발음 하 고 부드럽게 1 x PBS로 3 회 세척.</li>
	<li>30에 대 한 수정 프로그램 솔루션의 100 µ L 96 잘 접시의 각 잘 셀 수정 실 온에서 s.</li>
	<li>고정, 후 수정 솔루션을 발음 하 고 37 ° c.에 prewarmed 이온된 수 3 번 부드럽게 씻어 이온된 수 발음</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 트랩 얼룩의 100 µ L을 추가 하 고 37 ° C에서 30 분 한 빛에서 방패는 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>얼룩, 후 발음 트랩 얼룩 하 고 부드럽게 이온된 물으로 3 회 세척.</li>
	<li>이미지 osteoclasts 40 X 확대는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여.</li>
</ol>7. 트랩 활동 부 량의 문화 매체
<ol><li>표면에 뜨는 30 µ L 문화 단계 5.1, 5.4, 5.8; 96 잘 접시의 각 우물에서 수집 비 경작 osteoclast 유도 매체의 30 µ L를 사용 하 여 부정적인 제어. 샘플을 새로운 96 잘 접시에 놓습니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 기판 mixture(1.5.5)의 90 μ를 추가 합니다.</li>
	<li>1 h와 빛 으로부터 방패에 대 한 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음에 3 M NaOH의 50 µ L을 추가 하 여 반응을 중지 합니다.</li>
	<li>405의 파장에서 theabsorbance 측정 nm.</li>
</ol>8. 서 부 럽
참고: 6-7 일 후 24-잘 접시에 생체 외에서 문화, 성숙한 osteoclasts 표시 되어야 합니다.
<ol><li>매체 발음</li>
	<li>부드럽게 씻어 미리 PBS 3 시간 x 1 냉각.</li>
	<li>PBS 발음</li>
	<li>SDS 세포의 용 해 버퍼 포함 프로 테아 제 억제 물 칵테일 x 1의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>10 분 동안 105 ° C에서 열 lysates 및 12000 × g와 4 ° C에서 원심 분리기는 10 분에 대 한 단백질을 포함 하는 supernatants 수집 합니다.</li>
	<li>Lysates 10 %SDS 페이지11 30 µ g의 단백질을 포함 하 고 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막에 전송 합니다.</li>
	<li>30 분 동안 5% 탈지 우유와 함께 막 차단 합니다.</li>
	<li>반대로 랩 터, 안티-P-S6, S6 안티, 안티-β-말라 4 ° C에서 5% 탈지 우유에 1:1,000 희석 하룻밤에 막 품 어.</li>
	<li>실 온에서 10 분 동안 Tris 버퍼 염 트윈 20 (TBST)와 함께 막 씻으십시오.</li>
	<li>단계 8.9 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 막 품 어-실 온에서 1 h 5% 탈지 우유에 1:5,000 희석에 반대로 마우스 또는 토끼 IgG 항 체를 활용.</li>
	<li>실 온에서 3 시간 10 분 동안 TBST 가진 막을 씻어.</li>
	<li>Chemiluminescent 탐지에 대 한 세포 막에 서쪽 chemiluminescent HRP 기질을 추가 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어. 초과 기판 배수와 x 선 필름에도 말을 폭로.</li>
</ol>

<ol>
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모든 저자 들은 관심의 없습니다 충돌 상태.

Osteoclastogenic 분석 결과 격리 하 고 문화 osteoclasts 생체 외에서12,13가장 널리 사용 되는 방법 이다. 동안 여러 RANKL 기반 osteoclast inductions 설명된13,,1415, 현재 연구는 이전 방법에 따라 일부 수정 프로토콜을 설명 합니다.
이전 연구에서 BMMs는 절연<sup class="xref...

뼈는 끊임없이 변화 장기 이며 osteoblasts 그리고 생활 내내 osteoclasts에 의해 개조. Osteoclasts 광물 화 된 매트릭스 재흡수에 대 한 책임은 osteoblasts 합성 하 고 새로운 뼈 매트릭스1분 비. 뼈 재흡수와 골 형성 사이 균형은 뼈의 유지 보수를 포함 하는 뼈 건강에 중요 한 대량 및 자극과 상해에 대 한 응답. 이 균형을 방해 하는 경우 골다공증 및 치 주 질환을 포함 한 일련의 뼈 대사 질환 발생할 수 있습니다. 이 질병에서 뼈 질량 손해 osteoclastic 뼈 재흡수 osteoblasts2,3의 능력을 형성 하는 뼈를 초과 합니다. 따라서, 골다공증 같은 골격 질환을 치료 하 제약 목표를 개발 하기 위하여 그것은 생성 및 osteoclasts4의 생물학을 이해 하는 중요 한.
Osteoclasts 독특한 거 대 한 multinucleated 세포 나 뼈 표면 근처에 위치 하 고 monocyte/대 식 세포 가족1에 속한다. Ibbotson K. J. 외. 1, 25-dihydroxy-비타민 D35를 포함 하는 매체와 osteoclast 같은 세포에서 생체 외에서 생성 하는 방법을 보고. Osteoclast 형성의 필수적인 요인으로 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 및 핵 요인-κ B ligand (RANKL)에 대 한 수용 체 활성의 식별 극적으로 osteoclastogenesis 체 외 의 효율성 증가 1 , 6 , 7. 수 문화 osteoclasts에서 생체 외에서 세대의 우리의 이해와 osteoclasts의 규제 개선 했다.
2 구조적 및 기능적으로 뚜렷한 단지, 즉 mTORC1 및 mTORC28,9rapamycin (mTOR) 함수의 포유류/기계적 대상. 두 다 단백질 복합물은 다릅니다 서로 그들의 서로 다른 구성 요소와 다운스트림 기판. mTORC1 mTORC2 포함 mTOR (Rictor)9의 rapamycin을 구분 하지 않는 동반자 mTOR (랩 터)의 독특한 규정 관련 단백질을 포함 합니다. mTORC1 통합 하 고 통제 세포 성장, 증식 및 분화에 중요 한 신호를 전송할 수 있습니다. 최근에, 우리는 mTORC1 중요 한 역할 catabolic 뼈 재흡수의 네트워크에서 랩 터 osteoclasts10에서 mTORC1을 비활성화에 삭제에 의해 입증. 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 야생-타입 (WT) 및 랩Ctsk 마우스의 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 osteoclasts를 생성 하 고 mTORC1 비활성화 osteoclast에의 영향을 공부 RANKL 기반 osteoclastogenic 메서드 사용 되었다 형성입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Raptorfl/fl mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>013188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctsk-cre mice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>a gift from S. Kato, University of Tokyo, Tokyo, Japan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-022-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>Gibico</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>BioInd</td>
			<td>04-001-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse M-CSF protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3U4F9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse RANKL protein</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>Q3TWY5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC lysis buffer</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C3702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Garnet GBC Base solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Nitrite Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naphthol AS-BI Phosphate Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3873</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-031-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tartaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium tartrate dibasic dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>s4797</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnCl2</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Shanghai Chemical Co. Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase substrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4744</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Raptor</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P-ribosomal protein S6 (S235/236)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2317</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ribosomal protein S6</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#946;-actin</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-130300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>Xilong scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>00000367MSDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IX71</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45-mm Syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissor</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mosquito forcep</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rankl-based osteoclast culture assay of mouse bone marrow to investigate the role of mtorc1 in osteoclast formation

Osteoclasts 뼈 resorbing 고유는 골의 monocyte/대 식 세포 계보에서 차별화 하는 셀. Osteoclasts의 장애는 뼈 대사 질환, 골다공증 등의 시리즈에 발생할 수 있습니다. 병 적인 뼈 질량 손실의 방지를 위한 제약 목표를 개발 하는 선구자에서 osteoclasts 분화 메커니즘 이해 되어야 한다. 격리 하 고 많은 osteoclasts에서 생체 외에서 문화 능력이 osteoclast 차별화에 특정 한 유전자의 역할을 결정 하기 위해 중요 합니다. Osteoclasts에 복잡 한 1 (TORC1) rapamycin의 포유류/기계적 대상의 비활성화 수 osteoclast 수 감소와 증가 뼈 질량; 그러나, 근본적인 메커니즘 추가 연구 필요. 현재 연구에서 mTORC1 비활성화 osteoclast 형성에의 영향을 공부 하 고 분리 하 고 마우스 골 수에서 osteoclasts 문화 RANKL 기반 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 성공적으로 일반적으로 1 주일 이내 거 대 한 osteoclasts의 많은 수에서 결과. 랩 터 의 삭제 osteoclast 형성 장애 고 분 비 주석산 저항 산 성 인산 가수분해 효소, 그 mTORC1을 나타내는 osteoclast 형성에 대 한 중요 한의 활동을 감소.

현재 프로토콜을 사용 하 여, 많은 수의 거 대 한 osteoclasts에 볼 수 있었다 주 6; 거 대 한 osteoclasts 볼 수 없습니다, osteoclast 차별화의 한 더 날 수 있습니다 (그림 1) 필요. 성공적인 osteoclast 대형 함정 얼룩 (그림 2A)에 의해 확인 됐다. Osteoclasts 이상의 3 핵으로 거 대 한 와인 레드/보라색 셀을 했다. 250 개 이상의 osteoclasts WT BMMs (<str...

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A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

RANKL 기반 Osteoclast 문화 분석 결과의 마우스 골 수 mTORC1 Osteoclast 형성에의 역할을 조사 하

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

12.7K 조회수.  National Clinical Research Center of Stomatology. 이 원고 osteoclast 형성에서 복잡 한 1 rapamycin의 포유류/기계적 대상의 역할을 연구 하 고 마우스 골 수에서 분리 및 문화 osteoclasts에 생체 외에서 프로토콜을 설명 합니다.

비디오: A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

연구

발생학

An Enzymatic Method to Rescue Mesenchymal Stem Cells from Clotted Bone Marrow Samples

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade clots in the bone marrow and release MSCs for further use. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to bone marrow resampling. Bone marrow is a major source of MSCs, which are interesting for tissue engineering and autologous stem cell therapies. Upon withdrawal bone marrow may clot, as it comprises all of the hematopoietic system. The resulting clots contain also MSCs that are lost for expansion culture or direct stem cell therapy. We experienced that 74% of canine bone marrow samples contained clots and yielded less than half of the stem cell number expected from unclotted samples. Thus, we developed a protocol for enzymatic digestion of those clots to avoid labor-intense and costly bone marrow resampling. Urokinase - a clinically approved and readily available thrombolytic drug &#8211; clears away the bone marrow clots almost completely. As a consequence, treated bone marrow aspirates yield similar numbers of MSCs as unclotted samples. Also, after urokinase treatment the cells kept their metabolic activity and the ability to differentiate into chondrogenic, osteogenic and adipogenic lineages. Our protocol salvages clotted blood and bone marrow samples without affecting the quality of the cells. This obsoletes resampling, considerably reduces sampling costs and enables the use of clotted samples for research or therapy.

Mesenchymal stem cells are usually obtained from bone marrow and require expansion culture. When samples clot before processing, a protocol using the (enzymatic) thrombolytic drug urokinase can be applied to degrade the clot. Thus, cells are released and available for expansion culture. This protocol provides a rapid and inexpensive alternative to resampling.

효소 방법은 응고 골수 샘플에서 중간 엽 줄기 세포를 구출

Mesenchymal stem cells (MSCs) - usually obtained from bone marrow - often require expansion culture. Our protocol uses clinical grade urokinase to degrade ...

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

공 촛점 분석을 사용하여<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em&gt;의 Wnt 및 쉬 Morphogen 그라디언트의 변조기를 조사하기 위해

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells (MPCs) from Human Bone Marrow

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel cell population specifically selected for growth in human serum supplemented medium. These cells are characterized by morphological, phenotypic, and molecular features distinct from MSCs and we named them Mesodermal Progenitor Cells (MPCs). MPCs are round, with a thick highly refringent core region; they show strong, trypsin resistant adherence to plastic. Failure to expand MPCs directly revealed that they are slow in cycling. This is as also suggested by Ki-67 negativity. On the other hand, culturing MPCs in standard medium designed for MSC expansion, gave rise to a population of exponentially growing MSC-like cells. Besides showing mesenchymal differentiation capacity MPCs retained angiogenic potential, confirming their multiple lineage progenitor nature. Here we describe an optimized highly reproducible protocol to isolate and characterize hBM-MPCs by flow cytometry (CD73, CD90, CD31, and CD45), nestin expression, and F-actin organization. Protocols for mesengenic and angiogenic differentiation of MPCs are also provided. Here we also suggest a more appropriate nomenclature for these cells, which has been re-named as "Mesangiogenic Progenitor Cells".

Isolating Mesangiogenic Progenitor Cells MPCs from Human Bone Marrow

Here we describe an optimized, highly reproducible protocol to isolate Mesodermal Progenitor Cells (MPCs) from human bone marrow (hBM). MPCs were characterized by flow cytometry and nestin expression. They showed the ability to give rise to exponentially growing MSC-like cell cultures while retaining their angiogenic potential.

사람 골수에서 분리 Mesangiogenic 전구 세포 (MPC와)

In a research study aimed to isolate human bone marrow (hBM)-derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) for clinical applications, we identified a novel ...

Culture of Murine Embryonic Metatarsals: A Physiological Model of Endochondral Ossification

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or longitudinal bone growth. As such, it is imperative that we further our understanding of the underpinning molecular mechanisms involved in such disorders so as to provide advances towards human and animal patient benefit. The mouse metatarsal organ explant culture is a highly physiological ex vivo model for studying endochondral ossification and bone growth as the growth rate of the bones in culture mimic that observed in vivo. Uniquely, the metatarsal organ culture allows the examination of chondrocytes in different phases of chondrogenesis and maintains cell-cell and cell-matrix interactions, therefore providing conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture. This protocol describes in detail the intricate dissection of embryonic metatarsals from the hind limb of E15 murine embryos and the subsequent analyses that can be performed in order to examine endochondral ossification and longitudinal bone growth.

We present a protocol to dissect and culture embryonic day 15 (E15) murine metatarsal bones. This highly physiological ex vivo model of endochondral ossification provides conditions closer to the in vivo situation than cells in monolayer or 3D culture and is a vital tool for investigating bone growth and development.

쥐 배아 중족골의 문화 : 연골 골화의 생리 학적 모델

The fundamental process of endochondral ossification is under tight regulation in the healthy individual so as to prevent disturbed development and/or ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

약물 치료와<em&gt; 생체</em&gt;은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

자세한 공간 식지도에서 동적 식 데이터의 시간적 순서

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

마우스 파골 세포 전구체의 노치 신호 전달의 자극

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global DNA methylation level of chondrocytes is considered to be a suitable biomarker for the loss of the chondrocyte phenotype. However, results based on different experimental methods can be inconsistent. Therefore, it is important to establish a precise, simple, and rapid method to quantify global DNA methylation levels during chondrocyte dedifferentiation.
Current genome-wide methylation analysis techniques largely rely on bisulfite genomic sequencing. Due to DNA degradation during bisulfite conversion, these methods typically require a large sample volume. Other methods used to quantify global DNA methylation levels include high-performance liquid chromatography (HPLC). However, HPLC requires complete digestion of genomic DNA. Additionally, the prohibitively high cost of HPLC instruments limits HPLC&#39;s wider application.
In this study, genomic DNA (gDNA) was extracted from human chondrocytes cultured with varying number of passages. The gDNA methylation level was detected using a methylation-specific dot blot assay. In this dot blot approach, a gDNA mixture containing the methylated DNA to be detected was spotted directly onto an N+ membrane as a dot inside a previously drawn circular template pattern. Compared with other gel electrophoresis-based blotting approaches and other complex blotting procedures, the dot blot method saves significant time. In addition, dot blots can detect overall DNA methylation level using a commercially available 5-mC antibody. We found that the DNA methylation level differed between the monolayer subcultures, and therefore could play a key role in chondrocyte dedifferentiation. The 5-mC dot blot is a reliable, simple, and rapid method to detect the general DNA methylation level to evaluate chondrocyte phenotype.

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

We present a method to quantify DNA methylation based on the 5-methylcytosine (5-mC) dot blot. We determined the 5-mC levels during chondrocyte dedifferentiation. This simple technique could be used to quickly determine the chondrocyte phenotype in ACI treatment.

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em&gt; 체외에서</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...