이 실험은 류마티스 관절염 및 치주염과 같은 염증성 뼈 붕괴 의 질병에 있는 항 c-fms 항체의 치료 가치를 강조합니다. 골수가 추출되어 골세포 전구체를 생성하는 데 사용되는 프로세스는 여러 다운스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있는 다량의 순수 한 골세포를 생성합니다. 이 프로토콜은 RANKL 리간드 또는 TNF 알파를 사용하여 두 가지 대체 골형성 을 제공합니다.
그 외에도, 이 방법은 항 c-fms 항체가 골세포 발생에 미치는 영향에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차의 시각적 데모는 해부 및 다량의 골수 세포를 얻는 과정에 연구원을 친숙시게합니다. 용기의 크기에 따라 약 50 밀리리터의 알파 MEM이 있는 수집 용기역할을 하는 접시를 채우기 시작하고 얼음 위에 놓습니다.
핀을 사용하여 안락사 된 마우스의 손바닥과 발을 관통하여 supine 위치에 고정하고 70 %의 에탄올로 철저히 스프레이하십시오. 멸균 수술 가위와 핀셋을 사용하여 엉덩이 수준에서 피부 절개를하고 발까지 확장하여 근육을 노출시십시오. 사두근 근육을 부착하는 힘줄을 찾아 잘라냅니다.
근육을 껍질을 벗기고 엉덩이 수준에서 자른다. 그런 다음 뼈에 햄스트링 근육을 부착하는 힘줄을 찾습니다. 뼈를 드러내는 근육을 벗겨내고, 햄스트링을 부착에서 풀어 뼈로 자르지 않도록 하십시오.
대퇴골의 머리와 공동 공간 사이에 가위를 배치합니다. 대퇴골을 풀어주지만 뼈를 그대로 유지하면 골수를 노출시킬 위험 없이 뼈를 분리할 수 있습니다. 비슷한 방식으로 경골에 부착 된 근육을 잘라.
그런 다음 오염을 피하기 위해 뼈를 그대로 유지하면서 발목 관절의 부착에서 경골을 잘라냅니다. 가위 블레이드와 실험실 물티슈를 사용하여 대퇴골과 경골에서 남은 연조직을 긁어 내고 얼음 위에 알파 MEM을 놓아 준비된 접시에 놓습니다. 해부는 오염을 최소화하기 위해 신중하게 수행해야합니다.
그래서 철저한 연조직 제거와 뼈 국소화가 중요합니다. 알파 MEM으로 30 게이지 바늘 주사기를 채웁니다. 경골과 대퇴골을 무릎 관절에서 분리하고 가위를 사용하여 양쪽에서 긴 뼈의 끝을 잘라냅니다.
핀셋을 사용하여 샤프트에서 뼈를 잡습니다. 골수 공간에 바늘을 삽입하여 골수의 함량을 6센티미터 배양 접시에 천천히 씻어 내고 모든 뼈를 반복합니다. 뼈는 모든 골수 함량의 추출을 나타내는 흰색으로 바뀝니다.
40 마이크로미터 나일론 세포 스트레이너를 사용하여 골수 추출물을 50밀리리터 원추형 원심분리기 튜브로 변형시려면. 튜브를 300배 G로 5분간 원심분리합니다. 상부체를 폐기합니다.
세척하려면 펠릿에 알파 MEM 5 밀리리터를 추가합니다. 세포를 분리하고 원심분리기를 분리하고 총 2회 세척을 반복합니다. 원고에 설명된 바와 같이 이러한 고립된 세포를 계산한 후, 10센티미터 배양 접시에 10 밀리리터 당 1,000만 개의 세포를 시드하고 세포에 M-CSF를 추가한다.
3일 동안 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. 3 일 후에 매체를 제거하고, 비 부착 세포를 제거하기 위해 PBS의 10 밀리리터로 두 번 격렬하게 세포를 씻는다. 실온 0.02%의 트립신-EDTA 및 PBS5밀리리터를 추가하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 5분간 배양합니다.
세포를 분리하기 위해 셀을 철저히 피펫합니다. 현미경으로 배양을 관찰하여 세포가 분리되어 둥근 상태로 표시되고 미디어에 떠 있는 것처럼 보이게 하십시오. 세포가 분리되면 알파 MEM의 5 밀리리터를 추가하여 반응을 비활성화합니다.
50 밀리리터 원모 관과 원심분리기는 5분 동안 300배 G로 세포를 수집합니다. 상체를 폐기한 후 알파 MEM 5밀리리터로 세척하고 원심분리기를 300회 G로 5분간 다시 세척합니다. 알파 MEM의 10 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.
10센티미터 배양 접시에 10 밀리리터 당 1백만 개의 세포를 시드하고 M-CSF를 추가합니다. 3일 동안 37도, 이산화탄소 5%로 배양합니다. BmM의 생성 도중 이전에 했던 것처럼 3 일 후에 골세포 전구체로 BMM을 나타내는 부착된 세포를 수확하십시오.
잘 당 96 웰 플레이트에서 알파 MEM의 200 마이크로 리터 당 50, 000 세포에서 BmM을 시드. 각 웰에 원하는 자극을 추가합니다. 그런 다음 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도를 위해 M-CSF를 추가합니다.
각 웰에 안티-c-fms 항체를 추가합니다. 4일 동안 매일 미디어를 변경하면서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 플레이트를 배양합니다. 그런 다음 원고에 설명된 대로 염색 및 에세이를 진행합니다.
항-c-fms 항체를 가진 M-CSF 및 RANKL 처리 배양에서 의 골세포 형성을 평가하였다. 101, 밀리리터 안티-c-fms 항체당 000 나노그램으로, 대조군과 비교하여 골세포 수의 현저한 감소가 관찰되었다. 반면, 밀리리터 안티-c-fms 항체당 10 나노그램 중 1개씩은 현저한 감소는 없었다.
이어서, 항-c-fm항체를 통해 M-CSF 및 TNF 알파 처리 배양에서 의골세포 형성을 평가하였다. 밀리리터 안티-c-fms 항체당 10, 100, 1, 000 나노그램으로, 밀리리터당 1나노그램에서 현저한 감소와 함께 대조군과 비교하여 골세포 수가 현저한 감소가 관찰되었다. 그리고 밀리리터 안티-c-fms 항체당 1, 10, 100 나노그램을 가진 M-CSF 배양, 대조군에 비해 골세포 전구체의 수는 현저한 감소는 없었다.
그러나, 밀리리터당 1, 000 나노그램에서, 골세포 전구체의 수가 현저히 감소하여 밀리리터당 1, 000 나노그램의 농도가 골세포 전구체의 증식을 현저히 억제하는 데 필요하다는 것을 나타낸다. 뼈를 그대로 유지하면서 결합을 해제하여 오염 가능성을 최소화하십시오.
