이 연구는 중국 서부 사범 대학(No. 20E059)에서 제공하는 박사 연구 시작 기금의 재정 지원으로 지원되었습니다.

1. PRRSV 유전자 템플릿의 제조
<ol><li>RNA 추출 시약 1mL에서 바이러스 스톡을 해동합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>클로로포름 0.2mL를 넣고 잘 섞는다. 3분 동안 배양합니다.</li>
	<li>혼합물을 4°C에서 12,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 알림: 혼합물은 무색 수성상, 간기 및 적색 페놀-클로로포름 상의 세 단계로 나뉩니다.</li>
	<li>무색 수성을 단계적으로 피펫하여 새 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>수성상을 0.5mL의 이소프로판올과 철저히 혼합하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다.</li>
	<li>4°C에서 12,000× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 참고: 튜브 바닥에는 흰색 RNA 침전물이 있습니다.</li>
	<li>마이크로피펫을 사용하여 튜브의 상층액을 버립니다.</li>
	<li>1mL의 75% 에탄올을 첨가하여 펠릿과 와류를 잠시 재현탁시킵니다.</li>
	<li>4 °C에서 7,500 × g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 마이크로피펫을 사용하여 튜브의 상층액을 버립니다.</li>
	<li>RNA를 5분 동안 건조시키고 RNase가 없는 물 20-50μL를 추가하여 RNA를 재현탁시킨 다음 철저히 혼합합니다.</li>
	<li>역전사 수행을 진행합니다. 표 1과 같이 역전사를 수행하기 위한 반응을 설정합니다. 참고: 성공적인 역전사를 보장하려면 고품질 RNA 템플릿을 사용하십시오.</li>
	<li>생성된 cDNA를 PCR에 사용하거나 -20°C에서 보관합니다.</li>
</ol>2. PCR 프라이머 디자인
<ol><li>포워드 프라이머 설계<ol><li>소프트웨어를 열고 새 DNA 파일을 선택하십시오.</li>
		<li>NCBI의 PRRSV 유전자 염기서열(GenBank: FJ548852.1)을 소프트웨어에 붙여넣습니다. 확인을 클릭하여 시퀀스 파일을 생성합니다.</li>
		<li>염기서열을 분석하고 단편 접합을 표시합니다. 단편의 전방 특이적 염기서열 프라이머를 설계합니다. 대부분의 경우 바람직한 용융 온도(Tm)는 55°C에서 62°C 사이이고 GC 함량은 40-60%입니다.</li>
		<li>Primers(프라이머)를 클릭하고 Add Primer(프라이머 추가)를 선택합니다.</li>
		<li>특정 염기서열을 붙여넣고 벡터의 overlap 염기서열을 특정 염기서열 primer의 처음 5' 뉴클레오티드에 추가합니다. 각 접합 근처에서 20-40 bp를 선택하여 인접한 두 조각 사이의 겹침 영역으로 사용합니다.</li>
		<li>돌출부와 특정 염기서열을 포함하는 전방 프라이머의 이름을 지정합니다( 보충 그림 S1 참조).</li>
		<li>Add Primer to Template(템플릿에 입문서 추가)을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>리버스 프라이머 설계<ol><li>염기서열을 분석하고 소프트웨어에서 단편 접합을 표시합니다. 단편의 역 특이적 염기서열 프라이머를 설계합니다.</li>
		<li>Primers(프라이머)를 클릭하고 Add Primer(프라이머 추가)를 선택합니다.</li>
		<li>특정 염기서열을 붙여넣고 제한 부위를 특정 염기서열 프라이머의 처음 5' 뉴클레오티드에 추가합니다. 참고: 추가된 제한 사이트는 여러 복제 사이트를 제외하고 삽입 조각과 벡터에 없어야 합니다.</li>
		<li>벡터의 20-40 bp 돌출 서열을 제한 부위의 처음 5' 뉴클레오티드에 추가합니다.</li>
		<li>돌출부와 특정 염기서열을 포함하는 역 프라이머의 이름을 지정합니다( 보충 그림 S1 참조).</li>
		<li>Add Primer to Template(템플릿에 입문서 추가)을 클릭합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 단편을 증폭하는 PCR
<ol><li>6 개의 개별 PCR 반응을 설정하십시오 (표 2) : 단편 1의 경우 프라이머 P1 및 P2를 사용하십시오 ( 보충 그림 S2 참조). 단편 2의 경우 프라이머 P3 및 P4를 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 3의 경우 프라이머 P5 및 P6을 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 4의 경우 프라이머 P7 및 P8을 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 5의 경우 프라이머 P9 및 P10을 사용하십시오. 프라이머 P11 및 P12를 사용하여 단편 6을 증폭합니다( 보충 그림 S2 참조). 알림: 사용하기 전에 각 구성 요소를 해동, 혼합 및 잠시 원심분리하십시오.</li>
	<li>표 2의 3단계 프로토콜을 사용하여 PCR을 실행합니다.</li>
	<li>PCR 산물 5 μL에 1 μL의 6x DNA 로딩 버퍼를 추가하고 혼합한 후 내용물을 잠시 원심분리합니다.</li>
	<li>1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 샘플을 분석합니다.</li>
</ol>4. PCR 단편의 정제
참고: 겔 추출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 겔에서 PCR 산물을 정제하는 것은 벡터 구성에 중요합니다.
<ol><li>PCR 산물 45 μL에 9 μL의 6x DNA 로딩 버퍼를 추가하고 혼합한 후 내용물을 잠시 원심분리합니다.</li>
	<li>DNA 단편을 분리하기 위해 1% 아가로스 겔/골드뷰 전기영동을 수행합니다. 참고: pH 값이 DNA 절편 회수에 영향을 미치므로 TAE 실행 버퍼를 재사용하지 마십시오.</li>
	<li>띠를 적절하게 분리한 후 날카로운 메스를 사용하여 DNA 띠를 조심스럽게 절제합니다. 알림: 과도한 아가로스를 잘라내어 겔 슬라이스의 크기를 최소화합니다.</li>
	<li>깨끗한 1.5mL 미세원심분리기 튜브에서 겔 절편의 무게를 측정하고, 겔 절편에 동일한 부피의 결합 완충액을 추가하고(예: 0.3mL에서 0.3g 절편), 60°C에서 7분 동안 배양합니다.</li>
	<li>2mL 수집 튜브에 미니 컬럼을 삽입합니다. 4.4단계에서 700μL의 DNA/아가로스 용액을 미니 컬럼에 추가합니다.</li>
	<li>10,000× g 에서 실온에서 1분 동안 원심분리합니다. 여과액을 버리고 수집 튜브를 재사용하십시오.</li>
	<li>300μL의 결합 완충액을 추가하고 실온에서 1분 동안 13,000× g 에서 원심분리기를 추가합니다. 여과액을 버리고 수집 튜브를 재사용하십시오.</li>
	<li>700μL의 세척 버퍼와 13,000× g 의 원심분리기를 실온에서 1분 동안 추가합니다. 여과액을 버리고 수집 튜브를 재사용하십시오.</li>
	<li>빈 미니 컬럼을 최대 속도로 2분 동안 돌려 컬럼 매트릭스를 건조시킵니다. 미니 컬럼을 깨끗한 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>20μL의 탈이온수를 컬럼 멤브레인 중앙에 직접 추가하고 실온에서 2분 동안 그대로 둡니다. 13,000 × g 의 속도로 1분 동안 원심분리기</li>
	<li>DNA를 -20 °C에서 보관합니다.</li>
</ol>5. 선형화된 벡터의 준비
NOTE: 플라스미드를 준비한 후 선택한 효소를 사용하여 절단할 수 있습니다. 긴 소화 또는 이중 효소 분해는 모든 DNA의 소화를 보장하는 데 매우 중요합니다. 이렇게 하면 후속 실험에서 위양성 클론의 수를 줄일 수 있습니다.
<ol><li>pVAX1 선형화
	<ol><li>반응 혼합물을 표시된 순서대로 실온에서 제조한다(표 3). 알림: 표시된 총 반응량을 유지하기 위해 물의 부피를 추가해야 합니다. 여기서, 플라스미드 1 μg을 반응 혼합물에서 효소로 절단하였다. 플라스미드 농도에 따라, 플라스미드의 부피는 반응 혼합물에서 조정될 수 있습니다.</li>
		<li>부드럽게 섞는다. 그런 다음 스핀 다운. 37°C의 열 블록 또는 물 온도 조절기에서 60분 동안 배양합니다.</li>
		<li>겔 추출 키트를 사용하여 섹션 4의 PCR 단편 정제와 유사한 겔 정제를 수행합니다( 재료 표 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>pVAX1-F1 선형화 참고: pVAX1-F1은 pVAX1(NdeI 및 HindIII) 및 단편 1 재조합의 첫 번째 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F2는 pVAX1-F1(NdeI) 및 단편 2 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F3는 pVAX1-F2(NdeI) 및 단편 3 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F4는 pVAX1-F3(NdeI) 및 단편 4 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다. pVAX1-F5는 pVAX1-F4(EcoRV 및 NtoI) 및 단편 5 재조합의 라운드에서 얻은 벡터입니다.<ol><li>각 벡터에 대해 표시된 순서대로 실온에서 반응 혼합물을 별도로 준비합니다(표 3).</li>
		<li>부드럽게 섞는다. 그런 다음 스핀 다운. 37°C의 열 블록 또는 물 온도 조절기에서 60분 동안 배양합니다.</li>
		<li>겔 추출 키트를 사용하여 섹션 4의 PCR 단편 정제와 유사한 겔 정제를 수행합니다( 재료 표 참조).</li>
	</ol></li>
</ol>6. 새 벡터로 서브클로닝
참고: 50-200 ng의 벡터 및 인서트를 사용할 때 우수한 클로닝 효율을 달성할 수 있습니다.
<ol><li>ExonArt Seamless 클로닝 및 어셈블리 반응을 설정합니다(표 4). 멸균된 탈이온화된H2O를 사용하여 총 반응량을 10μL로 조정하고 혼합합니다.</li>
	<li>50 ° C에서 15-60 분 동안 thermocycler에서 반응을 배양합니다. 샘플을 얼음에 보관하십시오. 알림: 인큐베이션을 최대 60분까지 연장하면 조립 효율성이 향상될 수 있습니다.</li>
	<li>DH5α 화학적으로 적합한 세포를 얼음 위에서 해동합니다.</li>
	<li>조립 생성물 10μL를 competent cell에 추가합니다. 그런 다음 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>혼합물을 얼음 위에 30분 동안 올려 놓습니다.</li>
	<li>45°C에서 45초 동안 열 충격을 가하고 튜브를 얼음 위로 3분 동안 옮깁니다.</li>
	<li>튜브에 900μL의 SOC 매체를 추가합니다.</li>
	<li>225rpm에서 37°C 진탕 인큐베이터에서 1시간 동안 튜브를 흔듭니다.</li>
	<li>6,000× g 에서 2분 동안 변형 반응을 원심분리합니다. 상층액을 버리고 100μL의 신선한 SOC 배지에 세포를 재현탁시킵니다.</li>
	<li>형질전환된 세포 현탁액을 50μg/mL 카나마이신이 있는 별도의 LB 플레이트에 펴 바릅니다.</li>
	<li>모든 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다. 각 실험 플레이트에서 분리된 개별 콜로니를 선택합니다.</li>
</ol>7. 형질전환체 분석
<ol><li>50 μg/mL 카나마이신을 함유한 20 μL의 LB 배지에 8개의 콜로니를 선택합니다.</li>
	<li>colony PCR 반응을 설정하고 PCR을 실행합니다(표 5). 참고: 단편 1에 대한 콜로니 PCR 반응의 경우 프라이머 P1 및 P2를 사용하십시오( 보충 파일 1 참조). 단편 2의 경우 프라이머 P3 및 P4를 사용합니다( 보충 파일 1 참조). 단편 3의 경우 프라이머 P5 및 P6을 사용합니다( 보충 파일 1 참조). 단편 4의 경우 프라이머 P7 및 P8을 사용하십시오( 보충 그림 S2 참조). 단편 5의 경우 프라이머 P9 및 P10을 사용하십시오. 프라이머 P11 및 P12를 사용하여 단편 6을 검출합니다( 보충 그림 S2 참조).</li>
	<li>PCR 산물 5 μL에 6x DNA 로딩 완충액 1 μL를 첨가하고 혼합한 후 내용물을 잠시 원심분리합니다.</li>
	<li>1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 결과를 분석합니다.</li>
	<li>50μg/mL 카나마이신을 함유한 5mL의 LB 배지에 하나의 양성 콜로니를 선택하고 37°C에서 밤새 성장시킵니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 plasmid DNA mini kit( 재료 표 참조)를 사용하여 plasmid를 얻습니다.</li>
	<li>1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 결과를 시각화합니다.</li>
</ol>

pVAX1 발현 벡터에서 full-length PRRSV 유전자 클로닝

<ol>
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저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

Gibson 조립 기술은 DNA 단편8의 조립을 위한 시험관 내 재조합 기반 분자 클로닝 방법입니다. 이 방법을 사용하면 단일 튜브 등온 반응에서 여러 DNA 단편을 원형 플라스미드로 조립할 수 있습니다. 그러나 Gibson Assembly 기술의 장애물 중 하나는 cDNA에서 긴 단편을 획득하는 것입니다. 긴 조각은 여러 가지 이유로 정확하게 증폭하기 어렵습니다. 예를 들어, 프라이머는 장시간 ?...

원핵 및 진핵 세포에서 발현을 위한 DNA 기반 실험 도구를 구성하는 데 필수적인 기술로서 분자 클로닝은 실험 생물학의 매우 중요한 구성 요소입니다. 분자 클로닝은 삽입 DNA의 획득, 적절한 벡터로의 삽입물의 ligation, 재조합 벡터를 대장균(E. coli)으로의 변환, 양성 클론의 식별의 네 가지 프로세스를 포함합니다1. 지금까지 제한 효소 2,3 및 PCR 매개 재조합 4,5,6을 사용하여 DNA 분자를 결합하기 위해 여러 가지 방법이 채택되었습니다. Seamless cloning 기술로 알려진 Homologous recombination은 벡터에 하나 이상의 DNA 단편을 서열에 독립적이고 흉터 없이 삽입할 수 있는 클로닝 방법 그룹입니다. 이 기술에는 염기서열 및 결찰 독립적 클로닝(SLIC), 이음매 없는 결찰 클로닝 추출물(SLiCE), In-Fusion 및 Gibson Assembly가 포함됩니다. 엑소뉴클레아제를 사용하여 삽입체의 한 가닥과 벡터를 분해하여 응집력 있는 말단을 생성하고, 생체 내 수리 또는 시험관 내 재조합을 사용하여 포스포디에스테르 결합을 형성하여 삽입물을 벡터에 공유 결합합니다. 흉터 없이 모든 시퀀스에서 단일 insert를 벡터에 결합할 수 있는 기능은 매우 매력적입니다. 또한, 이 기술은 서열 제한 없이 미리 결정된 순서로 5-10개의 단편을 결합할 수 있는 능력을 가지고 있습니다.
많은 재조합 DNA 기술 중 하나로서, 현재 가장 효과적인 클로닝 방법 7,8인 Gibson Assembly 기술은 하나 또는 여러 선형화된 DNA 단편을 매끄럽게 조립하는 견고하고 우아한 엑소뉴클레아제 기반 방법입니다. Gibson Assembly 반응은 세 가지 효소, 즉 5' 엑소뉴클레아제, 고충실도 중합효소 및 내열성 DNA 리가아제의 혼합물을 사용하여 등온 조건에서 수행됩니다. 5'-3' 엑소뉴클레아제에 의해 생성된 단일 가닥 3' 돌출부는 한쪽 끝에서 상보성을 공유하는 단편의 어닐링에 기여합니다. 고충실도 중합효소는 dNTP를 첨가하여 어닐링된 단일 가닥 영역의 틈을 효과적으로 메우고, 내열성 DNA 리가아제는 흠집을 밀봉하여 결합 DNA 분자를 형성합니다8. 따라서, 이 기술적 방법은 유전자 발현 벡터의 구축에 널리 사용되어 왔다.
돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS)은9세에 PRRSV로 인해 돼지에서 생식 장애 및 호흡 부전을 일으키는 바이러스성 질병입니다. 이 증후군은 발열, 식욕 부진, 폐렴, 무기력, 우울증 및 호흡 곤란으로 나타납니다. 또한, 귀의 적색/청색 변색을 포함한 임상 징후가 일부 전염병에서 관찰되었습니다. PRRSV는 동맥바이러스과에 속하는 것으로, 소변, 초유, 타액을 포함한 체액의 직접적인 접촉 및 교환을 통해 돼지고기 생산국에 널리 전염됩니다. 미국에서 PRRSV의 확산으로 인해 돼지 고기 산업의 총 경제적 손실은 580 만 마리의 암퇘지와 1 억 1 천만 마리의 돼지의 사육 규모를 기준으로 연간 약 6 억 6 천 4 백만 달러로 추정되었습니다10,11. 동식물건강검사국(Animal and Plant Health Inspection Service) 보고서에 따르면 백신을 접종하지 않은 돼지의 49.8%가 혈청12에서 PRRSV가 존재하며, 감염된 돼지에서 낮은 수준의 PRRSV가 타액, 코 분비물, 소변 및 대변을 통해 배설된다13. PRRSV 전파를 제어하기 위해 여러 전략이 구현되었습니다 14,15,16. 완전히 바이러스가 음성인 집단을 생성하거나 생물 안전성 및 관리를 개선하기 위한 제거 절차 외에도 백신을 투여하는 것은 PRRS를 통제하는 효과적인 수단입니다.
PRRSV는 약 15킬로베이스(kb) 길이의 외피, 단일 가닥, 양성 감지 RNA 바이러스입니다. PRRSV 게놈은 최소 10개의 열린 판독 프레임(ORF), 짧은 5' 번역되지 않은 영역(5' UTR) 및 3' 말단의 폴리(A) 꼬리로 구성됩니다(그림 1A)17. 음성 가닥 RNA 바이러스의 게놈은 비감염성인 반면 양성 가닥 RNA 바이러스의 게놈은 전염성이 있습니다. 바이러스 자손을 생성하기 위한 RNA 및 DNA transfection에는 두 가지 주요 전략이 있습니다18. 그러나 RNA 게놈에 해당하는 전장 단편을 클로닝하는 것은 감염성 클론 구축에 매우 중요합니다. PRRSV 게놈의 길고 복잡한 특성으로 인해 PCR을 통해 한 번에 전체 길이 게놈을 쉽게 얻을 수 없습니다. 또한 PRRSV 유전자의 인공 합성이 효과적인 해결책이지만 긴 단편을 합성하는 데는 종종 비용이 많이 듭니다. 따라서 PRRSV 전장 발현 벡터를 얻기 위해 다중 삽입 상동 재조합 방법19,20으로 생성하려고 시도했습니다. 불행히도, 우리는 전장 유전자 발현 벡터를 얻을 수 없었습니다. 따라서 본 연구에서는 역프라이머에 적절한 restriction site를 추가하고 여러 차례의 상동 재조합 반응을 통해 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 성공적으로 획득했습니다. 또한, 이 방법은 표적 유전자의 결실 또는 돌연변이를 달성할 수 있으며 많은 수의 DNA 단편을 발현 벡터에 효율적으로 결합할 수 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 kb plus DNA Ladder</td>
			<td>Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd</td>
			<td>MD113-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Universal Green PCR Master Mix</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A303-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FRESCO17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clean Bench</td>
			<td>Sujing Antai Air Technology&#160; Co., Ltd</td>
			<td>VD-650-U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Electrophoresis Equipment</td>
			<td>Cleaver Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>170905117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Loading Buffer (6x)</td>
			<td>Biosharp Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>BL532A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. Z. N. A. Gel Extraction kit</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D2500-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I</td>
			<td>Omega Bio-Tek Co., Ltd</td>
			<td>D6943-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electro-heating Standing-temperature Cultivator</td>
			<td>Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd</td>
			<td>DHP-9082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A101-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ExonScript RT SuperMix with dsDNase</td>
			<td>Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>A502-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest Eco321 (EcoRV)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest HindIII</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NheI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastDigest NotI</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>FD0596</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc XR</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Co., Ltd</td>
			<td>721BR07925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goldview Nucleic Acid Gel Stain</td>
			<td>Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd</td>
			<td>YB10201ES03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice Maker Machine</td>
			<td>Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>FMB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>12361010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar Plate (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B530113-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB sterile liquid medium (Kanamycin)</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B540113-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettors</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave Oven</td>
			<td>Panasonic Electric (China) Co., Ltd</td>
			<td>NN-GM333W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shakers</td>
			<td>Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd</td>
			<td>ZHWY-2102C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PRRSV virus</td>
			<td>Sichuan Agricultural University</td>
			<td>&#8212;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SnapGene</td>
			<td>GSL Biotech, LLC</td>
			<td>v5.1</td>
			<td>To design primers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 PCR Gradient Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories&#160; Co., Ltd</td>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE buffer</td>
			<td>Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.</td>
			<td>B040123-0010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific&#160; Co., Ltd</td>
			<td>15596026</td>
			<td>RNA extraction reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a seamless cloning approach for porcine reproductive and respiratory syndrome virus expression vector construction

유전자 발현 벡터의 구성은 실험 생물학에서 실험실 작업의 중요한 구성 요소입니다. Gibson Assembly와 같은 기술 발전으로 벡터 구성이 상대적으로 간단하고 효율적이 되었습니다. 그러나 돼지 생식기 호흡기 증후군 바이러스(PRRSV)의 전장 게놈이 cDNA의 단일 중합효소 연쇄 반응(PCR)으로 쉽게 증폭될 수 없거나 시험관 내에서 여러 삽입물의 상동 재조합으로 전장 유전자 발현 벡터를 획득하기 어려운 경우 현재의 Gibson Assembly 기술로는 이 목표를 달성하지 못합니다.
결과적으로, 우리는 PRRSV 게놈을 여러 단편으로 나누고 PCR 증폭 단편을 얻기 위해 역 프라이머에 적절한 제한 부위를 도입하는 것을 목표로 했습니다. 상동 재조합 기술에 의해 이전의 DNA 단편을 벡터에 결합한 후, 새로운 벡터는 제한 효소 절단 부위를 획득했습니다. 따라서 새로 추가된 효소 절단 부위를 사용하여 벡터를 선형화하고 업스트림 DNA 단편의 다운스트림에 다음 DNA 단편을 도입할 수 있습니다.
업스트림 DNA 단편의 3' 말단에 도입된 제한효소 절단 부위가 제거되고, 새로운 절단 부위가 다운스트림 DNA 단편의 3' 말단에 도입됩니다. 이런 식으로 DNA 조각을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다. 이 방법은 PRRSV 발현 벡터를 성공적으로 구성하는 데 적용할 수 있으며, 많은 수의 단편을 발현 벡터로 조립하는 데 효과적인 방법입니다.

As an essential technique to construct DNA-based experimental tools for expression in prokaryotic and eukaryotic cells, molecular cloning is a very important component of experimental biology. Molecular cloning involves four processes: the acquisition of insert DNA, ligation of the insert into the appropriate vector, transformation of the recombinant vector into Escherichia coli (E. coli), and identification of the positive clones1. So far, multiple methods have been adopted for joining DNA molecules by using restriction enzymes2,3 and PCR-mediated recombination4,5,6. Homologous recombination, known as seamless cloning technology, is the group of cloning methods, which allows sequence-independent and scarless insertion of one or more fragments of DNA into a vector. This technology includes sequence- and ligation-independent cloning (SLIC), Seamless Ligation Cloning Extract (SLiCE), In-Fusion, and Gibson Assembly. It employs an exonuclease to degrade one strand of the insert and a vector to generate cohesive ends, and either in vivo repair or in vitro recombination to covalently join the insert to the vector by forming phosphodiester bonds. The ability to join a single insert to a vector at any sequence without any scars is very appealing. Furthermore, the technology has the ability to join 5-10 fragments in a predetermined order without sequence restrictions.
As one of many recombinant DNA techniques, the Gibson Assembly technique, currently the most effective cloning method7,8, is a robust and elegant exonuclease-based method to assemble one or multiple linearized DNA fragments seamlessly. The Gibson Assembly reaction is performed under isothermal conditions using a mixture of three enzymes,namely, 5&#39; exonuclease, high-fidelity polymerase, and a thermostable DNA ligase. Single-strand 3&#180; overhangs created by the 5&#39;-3&#39; exonuclease contribute to the annealing of fragments that share complementarity at one end. The high-fidelity polymerase effectively fills the gaps in the annealed single-strand regions by adding dNTPs, and the thermostable DNA ligase seals the nicks to form joint DNA molecules8. Hence, this technical method has been widely used for the construction of gene expression vectors.
Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) is a viral disease that leads to reproductive impairment and respiratory failure in pigs caused by PRRSV at any age9. The syndrome is manifested as fever, anorexia, pneumonia, lethargy, depression, and respiratory distress. Moreover, clinical signs, including red/blue discoloration of the ears, have been observed in some epidemics. As a member of the family arterivirus, PRRSV is widely transmitted to pork-producing countries by direct contact and exchange of fluids, including urine, colostrum, and saliva. Due to the spread of PRRSV in the United States, the total economic losses of the pork industry have been estimated to be approximately $664 million per year, based on the breeding scale of 5.8 million sows and 110 million pigs10,11. The Animal and Plant Health Inspection Service report shows that 49.8% of unvaccinated pigs show the presence of PRRSV in serum12 and low levels of PRRSV in infected pigs are excreted through saliva, nasal secretions, urine, and feces13. Multiple strategies have been implemented to control PRRSV propagation14,15,16. In addition to elimination procedures to create completely virus-negative populations or improving biosafety and management, administering vaccines is an effective means of controlling PRRS.
PRRSV is an enveloped, single-stranded, positive-sense RNA virus with a length of approximately 15 kilobases (kb). The PRRSV genome consists of at least 10 open reading frames (ORFs), a short 5&#39; untranslated region (5&#39; UTR), and a poly(A) tail at the 3&#39; terminus (Figure 1A)17. The genome of a negative-stranded RNA virus is non-infectious whereas the genome from positive-stranded RNA viruses is infectious. There are two main strategies for RNA and DNA transfection for generating virus progeny18. However, cloning the full-length fragment corresponding to the RNA genome is crucial for the construction of infectious clones. Due to the long and complex nature of the PRRSV genome, the full-length genome cannot be easily obtained through PCR at once. Additionally, although the artificial synthesis of PRRSV genes is an effective solution, the synthesis of long fragments is often expensive. Hence, to obtain the PRRSV full-length expression vector, we attempted to create it by the multiple inserts homologous recombination method19,20. Unfortunately, we were not able to obtain the full-length gene expression vector. Therefore, in this study, we added appropriate restriction sites to the reverse primer and successfully obtained the pVAX1-PRRSV expression vector by several rounds of homologous recombination reactions. Furthermore, this method can also achieve deletion or mutation of target genes and efficiently join a large number of DNA fragments to the expression vector.

저자 스포트라이트: Exploring cloning techniques for full-length DNA fragments

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 발현 벡터 구축을 위한 원활한 클로닝 접근법

This protocol demonstrates the construction of a lengthy and intricate gene expression vector. When a full-length DNA fragment cannot be obtained by a single PCR from cDNA, or the full-length gene expression vector cannot be obtained by multiple-insert homologous recombination in vitro, this method is applicable. Currently, multiple-insert ligation cloning is used to obtain full-length DNA fragment for cloning into a suitable vector.This method can achieve deletion or mutation of target genes and efficiently join a large number of DNA fragments to the expression vector.

이 논문에서는 지속적으로 도입된 restriction site를 통해 reverse primer를 사용하여 겹치는 DNA 분자를 조립하고 수리하는 in vitro recombination system을 제시합니다(그림 1B). 이 체계는 선형 벡터의 준비를 포함하는 및 적합한 5' 연장 순서 및 제한 위치를 비치하는 뇌관을 가진 PCR에 의해 소개된 돌출부를 포함하는 삽입 파편의 준비를 포함하는 포함하는 간단한 능률적인 절차입?...

여기에서는 인서트의 3' 말단에 적절한 제한 부위를 도입하여 pVAX1-PRRSV 발현 벡터를 얻기 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 상동 재조합 기술을 통해 벡터를 선형화하고 DNA 단편을 벡터에 하나씩 결합할 수 있습니다.

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson ...

이 프로토콜은 길고 복잡한 유전자 발현 벡터의 구성을 보여줍니다. cDNA로부터 단일 PCR로 전장 DNA 단편을 얻을 수 없거나, 시험관내에서 다중 삽입 상동 재조합으로 전장 유전자 발현 벡터를 얻을 수 없는 경우, 이 방법이 적용 가능하다. 현재 다중 삽입 접합 클로닝은 적합한 벡터로 클로닝하기 위한 전장 DNA 단편을 얻는 데 사용됩니다.이 방법은 표적 유전자의 결실 또는 돌연변이를 달성할 수 있으며 많은 수의 DNA 단편을 발현 벡터에 효율적으로 결합할 수 있습니다.

a-seamless-cloning-approach-for-porcine-reproductive-respiratory

Research

JoVE Journal

Biology

A Seamless Cloning Approach for Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Expression Vector Construction

347 조회수.  China West Normal University. 이 프로토콜은 길고 복잡한 유전자 발현 벡터의 구성을 보여줍니다. cDNA로부터 단일 PCR로 전장 DNA 단편을 얻을 수 없거나, 시험관내에서 다중 삽입 상동 재조합으로 전장 유전자 발현 벡터를 얻을 수 없는 경우, 이 방법이 적용 가능하다. 현재 다중 삽입 접합 클로닝은 적합한 벡터로 클로닝하기 위한 전장 DNA 단편을 얻는 데 사용됩니다.이 방법은 표적 유전자의 결실 또?...

비디오: 저자 스포트라이트: Exploring cloning techniques for full-length DNA fragments

The construction of gene expression vectors is an important component of laboratory work in experimental biology. With technical advancements like Gibson Assembly, vector construction becomes relatively simple and efficient. However, when the full-length genome of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus (PRRSV) cannot be easily amplified by a single polymerase chain reaction (PCR) from cDNA, or it is difficult to acquire a full-length gene expression vector by homologous recombination of multiple inserts in vitro, the current Gibson Assembly technique fails to achieve this goal.
Consequently, we aimed to divide the PRRSV genome into several fragments and introduce appropriate restriction sites into the reverse primer for obtaining PCR-amplified fragments. After joining the previous DNA fragment into the vector by homologous recombination technology, the new vector acquired the restriction enzyme cleavage site. Thus, we can linearize the vector by using the newly added enzyme cleavage site and introduce the next DNA fragment downstream of the upstream DNA fragment.
The introduced restriction enzyme cleavage site at the 3&#39; end of the upstream DNA fragment will be eliminated, and a new cleavage site will be introduced into the 3&#39; end of the downstream DNA fragment. In this way, we can join DNA fragments to the vector one by one. This method is applicable to successfully construct the PRRSV expression vector and is an effective method for assembling a large number of fragments into the expression vector.

Here, we present a protocol to obtain the pVAX1-PRRSV expression vector by introducing suitable restriction sites at the 3' end of the inserts. We can linearize the vector and join DNA fragments to the vector one by one through homologous recombination technology.

연구

생물학

PCR Primer Design for Cloning of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Gene

To begin, open the software and select the option to create a new DNA file. Prepare the PRRSV gene sequence from NCBI and click Okay to generate the sequence files. Analyze the sequence and mark the fragment junctions.Identify all the junctions before designing the specific sequence primers for the fragments. Then click on Primers and choose Add Primer. Paste the specific sequence and add overlap sequences of the vector to the first five prime nucleotide of the primer.Name the forward primer and click on Add Primer to Template to incorporate the designed primer into the template. Then mark the fragment junctions and design the reverse specific sequence primer of the fragments. Again, navigate to Primers and select Add Primer.Input the specific sequence. Add the restriction site to the first five prime nucleotide. Also, include 20 to 40 base pairs of vector overhang sequences to the first five prime nucleotide of the restriction site.Name the reverse primer and select Add Primer to Template. Next, set up six individual PCR reactions using the six fragments and designed primer pairs. Run the PCR following a three-step protocol as shown here.After PCR completion, pipette one microliter of six xDNA loading buffer with five microliters of the PCR product. Mix and centrifuge briefly. Analyze the samples using 1%agarose gel electrophoresis.To construct a full length gene, insert fragments of PRRSV were amplified using six PCR reactions. The sizes of the fragments were confirmed by agarose gel electrophoresis.

돼지 생식기 및 호흡기 증후군 바이러스 유전자의 클로닝을 위한 PCR Primer Design

Cloning of the Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Gene into the pVAX1 Vector

Begin by linearizing the vector. Prepare the reaction mixture containing specific restriction enzymes at room temperature. Use a gel extraction kit to purify the linearized vectors, then incubate a 37 degrees Celsius for 60 minutes.Then, assemble the exon R seamless cloning and assembly reaction to sub-clone the PRRSV gene. Adjust the total reaction volume to 10 microliters with sterilized deionized water. Then, thoroughly mix.Incubate the mixture in a thermocycler for 15 to 60 minutes at 50 degrees Celsius. Afterwards, store the samples on ice. After transforming the vector into competent cells, pick eight colonies into 20 microliters of LB medium containing kanamycin.Set up a colony PCR reaction to analyze the transformants. A full length PRRSV over-expression vector was obtained by introducing PRRSV fragment one into the pVAX1 vector, creating pVAX1-F1. Successive rounds of recombination using specific restriction enzymes resulted in incorporation of fragments two through five, visualized by an increase in plasmid size.