키토산 필름에 인간 치주 인대 세포 스페로이드의 형성

이것은 키토산 필름에 의한 치주 인대 세포 구체 구체를 배양하는 상세한 프로토콜입니다. 종래의 배양 시스템과 비교하여, 스페로이드 배양 시스템은 자가 재생 및 골성 분화 능력이 증가하여 치주 인대 세포를 생성합니다. 먼저 원고에서 지시한 대로 1%의 중량형 키토산 용액을 준비합니다.

24웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트의 각 웰에 키토산 용액 0.5 밀리리터를 넣습니다. 치토산 필름을 형성하기 위해 24 시간 동안 60섭씨 60도에서 오븐에서 접시를 건조하십시오. 키토산 필름을 중화하기 위해 24웰 플레이트의 각 웰에 0.5 일반 수산화나트륨을 넣고 실온에서 2시간 동안 배양한다.

그런 다음, 두 번 증류수로 키토산 필름을 세 번 씻는다. 키토산 코팅 24웰 플레이트를 실온에서 하룻밤 사이에 70% 알코올로 살균합니다. PBS로 플레이트를 세 번 헹구고 밤새 자외선 아래에 둡니다.

세포 파종, 전웜 증식 배지, PBS 용액 및 트립신 EDTA 용액이 섭씨 37도까지 떨어지기 전에. 세포 배양플라스크에서 상체를 버리고 PBS의 10 밀리리터와 함께 컨물수 치주 인대 또는 PDL 세포를 세척하십시오. PBS를 폐기하고 플라스크에 트립신 EDTA 솔루션 1밀리리터를 추가합니다.

플라스크를 섭씨 37도에서 3분간 배양한 다음 3밀리리터의 증식 배지를 추가하여 트립신 소화를 종료합니다. 세포 현탁액을 15 밀리리터 원물 튜브로 옮긴 다음 원심분리기를 300배g에서 5분간 분리합니다. 상체를 버리고 증식 배지의 500 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하십시오.

혈종계로 세포를 계산하고 평방 센티미터 당 5, 10, 30 및 60,000 개의 세포에서 접시에 씨앗을 넣습니다. PDL 세포를 5%의 이산화탄소와 가습공기로 섭씨 37도에서 배양하여 배양 배지를 일주일에 두 번 변화시다. 역상 대비 현미경을 통해 5 일 동안 매일 세포 형태를 관찰하십시오.

실행 가능한 PDL 세포 스페로이드는 이 프로토콜을 사용하여 성공적으로 형성됩니다. 스페로이드는 1일과 3일에 낮은 파종 밀도를 위해 거의 관찰되지 않습니다. 그러나 두 개의 높은 밀도에서, 스페로이드의 다양한 크기는 첫날부터 존재한다.

최적의 파종 밀도는 균일한 스페로이드를 초래하기 때문에 30,000 세포 제곱미터입니다. 문화의 5 일 후, 더 큰 스페로이드는 모든 파종 밀도에 대해 관찰된다. 생존 가능성 분석은 PDL 세포의 대다수가 1 일, 3 및 6 일에 살아 있다는 것을 보여줍니다, 그러나 죽은 세포의 수는 6 일째에 증가합니다.

이 프로토콜의 한 가지 제한은 스페로이드 형성 후 세포의 증식감소입니다. 따라서 스페로이드 형성 후 세포의 증식을 촉진하는 추가 연구가 필요합니다.