PCLS는 거의 손상되지 않은 조직 환경에서기도 및 혈관 평활근 세포 활성의 평가를 지원하여 폐 연구를위한 귀중한 생체 외 모델을 제공합니다. 평활근 연구의 용어로, 정밀 절단 폐 조각은 평활근 세포의 생체 내 표현형과 주변 구조와의 상호 작용을 보존하면서 평활근 세포에 대한 접근을 허용하며, 이는 세포 수준에서 기계론적 연구에 중요합니다. 시작하려면 마우스 몸체를 수핀 위치의 해부 보드에 놓습니다.
꼬리, 앞발 및 머리를 25G 주사기 바늘로 고정하고 70 % 에탄올로 몸을 살균하십시오. 흉강을 따라 조심스럽게 흉강을 열고 횡격막 위의 양측 열등한 흉곽을 엽니 다. 그런 다음 날카로운 가위 끝을 폐 조직에서 멀어지게하고 양측 복부 흉곽의 일부를 제거하여 심장을 노출시킵니다.
흉강이 열리면 폐 엽이 붕괴되는 것을 관찰하십시오. 가위를 사용하여 마우스 목의 연조직을 제거하여 기관을 노출시킵니다. 기관의 상단부에서 직경 1.2 밀리미터의 작은 구멍을 만들어 20G Y 자형 IV 카테터 팁을 통과시켜야합니다.
Y자형 카테터의 어댑터 포트 하나를 0.5밀리리터의 공기로 미리 채워진 3밀리리터 주사기로 연결하고, 다른 포트에는 섭씨 42도까지 가온된 1.5%agarose 용액 2밀리리터가 미리 채워진 3밀리리터 주사기로 연결합니다. 카테터를 채우기 위해 아가로스 용액을 주입 한 다음 카테터를 통해 기관 내로 5 ~ 8 밀리미터로 밀어 넣습니다. 천천히 아가로스 용액을 5 초 당 1 밀리리터의 속도로 주입하십시오.
폐가 근위축에서 원위 축을 따라 확장되는 것을 관찰하십시오. 각 폐 엽의 가장자리가 팽창 될 때 주사를 중단하십시오. 그런 다음 다른 주사기에서 0.2 ~ 0.3 밀리리터의 공기를 주입하여 잔류 아가로스를 전도성 기도로 밀어 원위 폐포 공간으로 밀어 넣습니다.
클립은 한 쌍의 곡선 지혈 포셉으로 기관을 닫았습니다. 폐 혈관 조직을 채우려면 따뜻한 6 % 젤라틴으로 1 밀리리터 주사기를 채우고 바늘 두피 정맥 카테터에 연결하십시오. 카테터에 젤라틴 용액을 채우고 바늘로 열등한 벽 가까이에서 우심실을 뚫습니다.
바늘을 우심실에 2 ~ 3 밀리미터 동안 밀어 넣고 바늘 끝을 주요 폐동맥으로 향하게하십시오. 약 0.2 밀리리터의 젤라틴 용액을 우심실 및 폐 동맥 혈관에 천천히 주입하십시오. 주사 후 다섯 분 동안 바늘을 제자리에 유지하고 심장과 폐에 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 부어 폐 엽을 식히고 몸을 냉장고에 넣으십시오.
이 단계 후, 가위로 주변 결합 조직에서 마우스 폐와 심장을 제거한다. 그런 다음 각 폐엽을 분리하고 얼음 위의 HBSS 용액에 보관하십시오. 폐 엽을 다듬고 절단 방향이 힐라에서 폐 표면까지의 대부분의 기도에 수직이 되도록 방향을 정합니다.
슈퍼 접착제로 표본 기둥 위에 부착하십시오. 신선한 얇은 면도날이있는 비브라 톰을 사용하여 폐 엽을 150 마이크로 미터 조각으로 자릅니다. 차가운 HBSS 용액으로 미리 채워진 멸균 페트리 접시에 조각을 모으십시오.
슬라이스를 DMEM/F-12 배지로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 실험 전에 하룻밤 사이에 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 단일 정밀 절단된 폐 슬라이스를 HBSS로 채워진 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 배치한다.
우물 중앙에서 슬라이스를 찾은 다음 피펫으로 HBSS 용액을 제거하십시오. 현미경으로 슬라이스에서 대상 기도와 용기를 찾은 다음 미리 절단된 중앙 구멍이 있는 나일론 메쉬를 사용하여 덮어 표적 기도 용기 영역을 노출시킵니다. 메쉬 위에 중공 금속 세탁기를 올려 조각을 제자리에 고정시킵니다.
그런 다음 600 마이크로 리터의 HBSS 용액을 첨가하여 조각을 잠급니다. 10분 후에 기준 이미지를 기록합니다. 기도 또는 혈관 수축을 유도하려면 피펫으로 HBSS 용액을 조심스럽게 제거하고 600 마이크로 리터의 HBSS를 작용제로 첨가하십시오.
칼슘 염료 로딩 완충액을 제조하기 위해, 먼저 10 마이크로리터의 DMSO와 0.2 그램의 플루로닉 F-12 분말로 50 마이크로그램의 염료를 DMSO의 1 밀리리터에 용해시킨다. 10 마이크로리터의 플루로닉 용액과 10 마이크로리터의 칼슘 염료 용액을 섞는다. 이 혼합물을 200 마이크로 몰의 설포브로모프탈레인을 함유하는 HBSS 용액 2 밀리리터에 첨가한다.
이어서, 15개의 정밀 절단된 폐 조각을 2밀리리터의 칼슘 로딩 완충액에 넣고, 섭씨 30도에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 100마이크로몰 설포브로모프탈레인을 함유하는 HBSS에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 칼슘 염료가 적재 된 조각을 큰 커버 유리에 놓습니다. 18G 무딘 바늘 또는 200 마이크로리터 피펫 팁에 부착된 3밀리리터 주사기에 고진공 실리콘 그리스를 채우고 슬라이스 위와 아래에 커버 글라스를 가로질러 두 개의 평행선을 그립니다.
두 그리스 라인 사이에 나일론 메쉬를 사용하여 슬라이스를 덮습니다. 두 번째 커버 글라스를 메쉬 위에 올려 놓고 챔버를 생성합니다. HBSS 또는 작용제 용액을 피펫으로 한쪽 끝에서 챔버에 첨가하십시오.
티슈 페이퍼로 다른 쪽 끝에서 흡입하여 챔버에서 유체를 제거하십시오. 슬라이스의 챔버는 이제 고속 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 칼슘 이미징을 할 준비가되었습니다. 폐기도 동맥 다발은 위상차 현미경 하에서 두께 150 마이크로미터의 정밀 절단된 폐 조각에서 관찰되었다.
휴지 상태에서, 기도는 근처의 폐동맥을 가진 입방체 상피 세포에 의해 확인되었다. 메타콜린에 노출된 후, 발광 영역은 감소하였고, 폐동맥은 자극에 대한 반응을 보이지 않았다. 기도 수축성 반응은 발광 면적 감소의 백분율에 의해 정량화되었고, 하루 및 오일 배양에서 유사한 용량 의존적 반응을 보였다.
말초 폐장에 도달하면, 전도성 기도는 호흡 덕트와 작은 acinar 세동맥을 둘러싸는 주머니로 분기합니다. 내피에 노출되면 기도와 폐동맥 모두 수축되고, 이어서 NOC-5가 이완을 유도한다. 휴지 상태에서, 칼슘 염료가 로딩된 슬라이스는 공초점 형광 현미경 하에서 기도 및 혈관 시스템의 평활근 세포에서 낮은 형광을 보였다.
작용제에 노출되면, 칼슘 형광 강도는 세포에서 상승하고 발진 신호와 상관 관계가있는 전체 세포로 전파되었습니다. 현명한 기술은, 아가로오스로 폐를 균질하게 팽창시키고 빠르거나 과도한 아가로스 주사를 피하는 것이 필수적입니다. 항상 끝에 공기를 밀어 전도성 기도에서 원위 폐포 공간으로 아가로스를 플러시합니다.
요약하면, 정밀-절단된 폐 슬라이스 배양물을 사용하여, 특수한 다양한 폐 평활근 기능을 제공하고 시험관내에서 평활근 조절 완화를 모델링할 수 있다. 또한 novo 혈관 확장 또는 기관지 확장제 약물을 스크리닝하는 이상적인 플랫폼을 제공합니다.
