이 비디오에는 활성화된 T 세포의 형질도입을 효율적으로 촉진하는 Drydux로 알려진 건식 거대다공성 알긴산 스캐폴드를 만들고 사용하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. Drydux는 바이러스가 파종된 RetroNectin 코팅 플레이트의 금 표준 시분획 대신 사용하도록 설계되었으며 세포 형질도입 공정을 단순화합니다. Drydux는 RetroNectin 코팅 플레이트의 스피노 클로케이션에 필적하는 형질 도입 효율을 가지며 기존 형질 도입 방법에 대한 저렴하고 편리한 대안으로 사용됩니다.
먼저 칼슘 -D- 글루 콘산 염의 0.4 % 용액을 준비하십시오. 멸균 여과된 DI 물을 비커의 칼슘-D-글루콘산염에 추가합니다. 칼슘 -D- 글루 콘산염이 녹을 때까지 중간 속도로 저어 주며 약 1 1/2 시간이 걸립니다.
일단 용해되면, 칼슘 -D- 글루 콘산 용액을 멸균 여과한다. 이 용액은 실온에서 보관할 수 있습니다. 다음으로 2 % 알긴산 용액을 준비하십시오.
이것은 스크류 캡 바이알 또는 비커를 사용하여 수행할 수 있습니다. 둘 다 여기에 표시됩니다. 조심스럽게 초순수 알긴산을 용기에 첨가하십시오.
알긴산염에 적절한 양의 DI 물을 첨가하십시오. 혼합을 방해하지 않는 가능한 가장 큰 교반 막대를 선택하고 용기에 추가하십시오. 알긴산염이 녹을 때까지 용액을 센 불에서 저어주면 약 1 시간이 걸립니다.
용기 측면에 큰 알긴산 덩어리가 있으면 용기를 옆으로 기울여 제거합니다. 작은 덩어리는 한 시간 동안 녹을 것이며 걱정할 필요가 없습니다. 2 % 알긴산 용액이 용해되면 교반 속도를 줄입니다.
알긴산 용액에 같은 부피의 칼슘 -D- 글루 콘산 용액을 천천히 첨가하십시오. 천천히 추가하면 가교 덩어리가 형성되는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 칼슘-글루콘산염 용액을 첨가하면 교반 속도를 높이고 15분 동안 격렬하게 저어줍니다.
용기를 옆으로 기울여 형성되었을 수 있는 덩어리를 제거합니다. 15분 동안 격렬하게 저어준 후 용액에 덩어리가 없는지 확인합니다. 용액을 48웰 또는 24웰 플레이트에 피펫팅합니다.
48웰 플레이트의 경우 각 웰에 300마이크로리터를 피펫팅합니다. 용액이 점성이 있고 팁에 달라붙을 수 있으므로 천천히 캐스팅하고 팁을 자주 교체하십시오. 24웰 플레이트의 경우 각 웰에 1밀리리터를 피펫팅합니다.
다시 천천히 캐스팅하고 피펫 팁을 자주 교체하십시오. 웰 플레이트를 뚜껑으로 덮고 섭씨 영하 20도에서 밤새 얼립니다. 뚜껑을 제거하고 물티슈와 고무 밴드로 상단을 고정하여 동결 건조기 용 플레이트를 준비하십시오.
플레이트를 동결 건조기 튜브에 넣고 72 시간 동안 동결 건조기에 올려 놓습니다. 72시간 후, 플레이트를 동결건조기로부터 제거한다. 이제 비계는 형질 도입에 사용할 준비가되었습니다.
비계를 즉시 사용하지 않을 경우 Parafilm으로 플레이트를 밀봉하고 필요할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. 장기간 보관하려면 Parafilm으로 밀봉하는 것 외에도 플레이트를 진공 밀봉하는 것이 좋습니다. 1, 500g의 원심 분리 필터를 통해 2 밀리리터의 바이러스 용액을 10 분 동안 원심 분리하여 바이러스 상청액을 농축시킨다.
스캐폴드 당 100 내지 200 마이크로리터의 농축된 바이러스가 필요하다. 농축된 바이러스 용액 부피가 200마이크로리터보다 큰 경우 몇 분 더 회전합니다. 각 스캐폴드에 대해 50마이크로리터의 완전한 세포 배양 배지에 현탁된 100만 개의 활성화된 T 세포의 분취량을 만듭니다.
농축된 바이러스를 세포 현탁액에 추가합니다. 세포 바이러스 현탁액의 총 부피는 48-웰 스캐폴드의 경우 200 마이크로리터, 또는 24-웰 스캐폴드의 경우 350 마이크로리터를 초과해서는 안 된다. 세포 바이러스 혼합물을 건조 스캐폴드의 상단에 적가합니다.
음성 대조군 실험의 경우 농축된 바이러스 대신 완전한 세포 배양 배지를 사용합니다. 이 세포 현탁액을 건조 스캐폴드의 상단에 추가합니다. 스캐폴드를 섭씨 37도의 세포 배양 인큐베이터에서 45 내지 60분 동안 배양한다.
인큐베이터에서 비계를 제거하십시오. 스캐폴드는 이 시간 동안 용액을 완전히 흡수해야 합니다. 증식을 유도하려면 IL-7 및 IL-15가 보충된 완전한 세포 배양 배지를 각 웰에 추가합니다.
IL-2도 사용할 수 있습니다. 24 웰 스캐 폴드의 경우 1 밀리리터를 추가하십시오. 48 웰 스캐 폴드의 경우 500 마이크로 리터를 추가하십시오.
섭씨 37도에서 72 시간 동안 배양하십시오. 세포는 72 시간 동안 증식하여 배지를 주황색으로 바꿀 수 있습니다. 각 웰에서 여분의 미디어를 제거하십시오.
스캐폴드에서 세포를 분리하려면 각 스캐폴드에 0.25몰 EDTA 용액을 추가합니다. 24웰 스캐폴드의 경우 1밀리리터, 48웰 스캐폴드의 경우 300마이크로리터를 추가합니다. 접시를 그대로 두거나 3-4 분 동안 부드럽게 저어줍니다.
대부분 용해되면 피펫을 우물 내부에서 부드럽게 안팎으로 넣습니다. 스캐폴드를 완전히 용해시키기 위해 몇 가지 안팎 피펫팅 단계가 필요할 수 있습니다. 용액을 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮깁니다.
세포를 PBS로 두 번 세척한다. 각 원심 분리기 튜브에 12 밀리리터의 PBS를 추가하십시오. 400g에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
튜브 바닥에 세포 펠릿이 형성됩니다. 상청액 용액을 흡인하고 세척을 반복하십시오. 모든 EDTA를 제거하는 것이 중요하므로 세척할 때마다 상층액을 완전히 제거하도록 주의하십시오.
PBS로 두 번째로 세척한 후, 세포 펠렛은 분석을 위해 준비된다. 각 그룹의 형질도입 효율을 결정하기 위해 유세포분석을 사용하였다. 형질도입되지 않은 세포는 음성 대조군으로서 사용되었고, 형질도입을 나타내지 않았다.
GFP 레트로바이러스가 없는 스캐폴드에 시딩된 세포도 형질도입을 나타내지 않았다. 건조 거대 다공성 알긴산 스캐폴드에 세포를 시딩한 활성화된 Drydux 그룹은 RetroNectin 그룹보다 약간 낮은 85%의 형질도입을 보였습니다. 이러한 결과는 Drydux 스캐폴드가 RetroNectin 코팅 플레이트의 시스핀코레이션 없이 레트로바이러스 유전자 전달에 의해 세포를 효과적으로 형질도입했음을 보여줍니다.
Drydux 스캐폴드는 RetroNectin에 필적하는 높은 형질도입 효율을 나타내어 T 세포 형질도입을 위한 대체 방법을 제공합니다. Drydux 스캐폴드 제조 비용이 저렴하기 때문에 이 공정은 CAR T 세포 치료 비용을 크게 낮출 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
