이 프로토콜에 사용되는 3D 프린팅 홀더를 사용하면 상처 입은 각막의 단기 세포 신호 전달 및 장기 세포 이동 이벤트를 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 지구를 온전하고 실행 가능하며 움직이지 않게 유지함으로써 이 프로토콜은 상피와 신경을 포함한 각막 세포의 고품질 라이브 이미지를 생성합니다. 3D 프린팅 홀더는 다양한 크기와 종의 지구본에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다.
또한 다른 영역을 이미지화하거나 나노 압흔 실험을 수행하기 위해 눈의 방향을 다르게 지정할 수도 있습니다. 시작하려면 안락사 된 마우스의 머리를 제거한 후 즉시 얼음 위에 놓아 조직의 생존력을 보존하십시오. 그런 다음 핀셋을 사용하여 지구본을 졸려서 핵을 공급하십시오.
그리고 핀셋으로 잡히는 곳 바로 아래에 해부 가위를 사용하여 시신경을 자릅니다. 칼슘 지시약 및/또는 세포막 염색을 포함한 P-35 세포 배양 접시에 2밀리리터의 배지에 글로브를 배양하여 섭씨 37도 및 저조도 조건의 5%이산화탄소의 인큐베이터에서 1시간 동안 배양하여 글로브가 얼룩 배지에 잠기도록 하여 균일한 염색을 위해 글로브가 얼룩 배지에 잠기도록 합니다. 홀더를 깨끗한 유리 바닥 커버 슬립에 부착하려면 홀더를 70 % 에탄올로 씻고 홀더에 접착제를 바르십시오.
그런 다음 홀더를 유리 바닥 덮개 슬립에 부착하여 접착제가 형광을 발하여 이미징을 복잡하게 만들 수 있으므로 홀더의 내부 영역 내에 접착제가 없는지 확인합니다. 접착제가 굳은 후 홀더가 덮개 슬립에 고정되어 있는지 확인하십시오. 멸균 스포이드를 사용하여 염색 용액에서 글로브를 제거하고 관심 부위의 조직 손상을 방지하도록 주의하십시오.
멸균 인산염 완충 식염수를 사용하여 실온에서 5분 동안 글로브를 세척하여 과도한 얼룩을 제거하고 글로브를 배지에 넣어 현미경으로 운반합니다. 관심 부위에 멸균 25게이지 바늘을 사용하여 지구본을 감으려면 멸균 스포이드를 사용하여 눈 뒤쪽에서 지구본을 집어 들고 잡고 지구본을 안정적으로 유지하고 구르는 것을 방지합니다. 긁힌 상처의 경우 멸균 된 25 게이지 바늘을 노출 된 각막을 가로 질러 부드럽게 움직이거나 바늘을 중앙 각막으로 직접 부드럽게 눌러 상처가 각막 기저막을 관통하지 않도록합니다.
각막 또는 윤부 부위를 홀더 내부 영역의 커버 슬립에 놓고 지구본이 올바르게 배치되고 관심 부위가 유리 커버 슬립과 접촉하는지 확인합니다. 접착제를 사용하여 홀더에 부착 된 3D 인쇄 커버를 사용하여 안정화하십시오. 조직 손상을 일으킬 수 있으므로 지구본을 제거하려고하지 마십시오.
현미경을 켜고 환경 챔버를 섭씨 35도 및 5% 이산화탄소로 설정하고 가습 챔버를 확인합니다. 커버 슬립 홀더와 안정화된 지구본을 라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 환경 챔버 및 이미지 내의 현미경 스테이지에 놓습니다. 탈수를 방지하고 조직 생존력을 유지하기 위해 커버 슬립에 추가 성장 배지를 조사하여 홀더의 지구본을 덮을 수 있는 충분한 배지가 우물에 있는지 확인합니다.
라이브 셀 이미징 기술을 사용하여 실험을 시작하면서 저전력 레이저 설정을 사용하여 조직을 보존하고 조직 손상을 방지하며 장기간 실험을 위한 적절한 목표를 달성합니다. 데이터 기록을 위해 CZI 파일의 기본 파일 형식으로 데이터를 기록하고 저장합니다. X 생체 각막에 대해 다층 구조의 고품질 이미징 데이터를 얻었으며 3D 인쇄 홀더로 안정화하여 각막의 정점, 기저 및 기질층에서 칼슘 신호 전달 이벤트를 입증했습니다.
스크래치 상처에서 3D 인쇄 홀더에 고정 된 각막의 Z 스택 이미지를 얻어 각막 층 전체의 세포막과 칼슘 신호 전달 및 다른 Z 평면에서의 칼슘 동원을 시각화했습니다. 치유 반응 동안 상처 침대로의 세포 이동을 연구하기 위해 각막의 시계열 실험을 수행하여 X, Y 또는 Z 방향으로 지구의 움직임이 거의 없음을 보여주었습니다. 지구본을 홀더에 놓으면 각막의 다른 영역이 중앙 및 각막 윤부 영역 모두에서 시각화 될 수 있음이 관찰되었습니다.
이 프로토콜을 통해 상처 치유의 차이를 나타내는 질병 모델의 눈을 이미지화할 수 있습니다. 우리는 세포 신호 전달의 이상과 살아있는 조직의 운동성을 특성화 할 수 있습니다.
