이 연구에 사용된 마우스 모델은 인간의 상피 중간엽 전이를 통해 폐 섬유에 대한 만성 니코틴 섭취 및 실리카에 대한 반복적인 노출의 영향을 효과적으로 시뮬레이션합니다. 배심원 부분 모델은 니코틴의 피하 주사와 실리카의 비강 점적에 의해 간단하고 신뢰할 수 있는 방법으로 달성되었습니다. 멸균 결정질 실리카를 식염수에 현탁시켜 리터당 20mg의 현탁액을 준비합니다.
초음파 진탕 수조에서 25분 동안 진동시킵니다. 실리카 현탁액을 와류 발진기가 있는 상태로 3분 동안 놓습니다. 현탁액을 흡인하여 혼합한 다음 비강 점적에 50마이크로리터를 사용합니다.
실리카 노출을 시작하려면 먼저 마취된 마우스를 한 손바닥에 놓고 마우스의 비강을 노출시킵니다. 4-8초 이내에 한쪽 콧구멍에서 50마이크로리터의 실리카 현탁액을 주입합니다. 서스펜션의 폐 침투를 빠르게 허용하려면 집게 손가락으로 마우스의 가슴을 3-5초 동안 부드럽게 누르고, 호흡수를 유지하기 위해 초당 3-5회 누르기를 반복합니다.
쥐가 균일한 호흡을 보이면 3분 동안 케이지에 넣어 관찰합니다. 1밀리리터 주사기에 0.2밀리리터가 표시될 때까지 공기를 흡입하여 니코틴 주사기를 준비합니다. 그런 다음 125마이크로리터의 니코틴을 빨아들입니다.
주사기를 두드려 바늘과 앞쪽 끝을 니코틴으로 채운 다음 빛으로부터 보호되는 트레이에 넣습니다. 오른손으로 쥐의 꼬리를 잡습니다. 마우스가 이완되면 왼쪽 엄지와 검지를 사용하여 꼬리에서 귀 가장자리까지 피부에 적당한 압력을 가합니다.
이제 오른손을 떼고 왼손, 작은 손가락, 약지를 사용하여 꼬리와 뒷다리를 꼬집어 마우스를 고정시킵니다. 오른손에 주사기를 잡고 머리에서 꼬리 방향으로 목 뒤쪽 피부에 구멍을 뚫습니다. 니코틴을 균일한 속도로 주입하십시오.
마취된 쥐를 폼 테스트 플레이트에 고정하고 털에 75% 알코올을 뿌립니다. 흉강을 노출시키는 복부 정중선을 따라 절개합니다. 심장 오른쪽 정점에 작은 절개를 만듭니다.
왼쪽 심장의 정점에서 20ml의 예냉식 PBS를 천천히 균일하게 주입하여 오른쪽 심장의 정점에 생성된 구멍에서 혈액이 흘러나오도록 합니다. 폐엽 전체를 제거하고 섭씨 영하 80도에서 냉장 보관합니다. 나머지 쥐에 4% 파라포름알데히드 10mL를 관류합니다.
PBS 관류 후 파라 포름알데히드 용액 30ml에 폐를 보존합니다. 72 시간 후, 준비된 고정액에 폐를 담그고 초음파 수조에 넣으십시오. 섭씨 40도에서 30분 동안 템퍼링합니다.
다음으로 조직을 75% 에탄올, 95% 에탄올, 무수 에탄올에 각각 50분 동안 넣어 탈수를 수행합니다. 폐 조직을 크실렌에 50분 동안 두 번 담가 조직을 세척합니다. 녹인 파라핀 왁스에 조직을 섭씨 55-60도에서 2-3시간 동안 둡니다.
왁스가 굳으면 절편 기계를 사용하여 4-5 마이크로 미터 두께의 폐 절편을 얻습니다. 초순수에서 섭씨 45도에서 섹션을 가열합니다. 왁스가 녹으면 부착 현미경 슬라이드에 폐 절편을 놓습니다.
헤마톡실린 및 에오신 염색 연구에 따르면 실리카와 결합된 니코틴에 노출된 마우스는 니코틴 또는 실리카 단독에 노출된 마우스보다 훨씬 더 심각한 폐 손상을 보였습니다. Masson의 염색은 다른 그룹에 비해 니코틴 실리카 조합에 노출된 폐의 콜라겐 섬유 침착이 증가했음을 보여주었습니다. 폐포 구조는 실리카에 노출된 마우스에서 파괴되었습니다.
면역조직화학적 연구는 니코틴과 실리카의 조합에 노출된 쥐에서 증가된 CD 2 zero six 양성 대식세포와 pro-fibrotic 인자, TGF 베타 1 양성 세포를 밝혔다. Vimentin 발현은 다른 그룹에 비해 이중 발현을 받은 마우스에서 더 높았습니다. 면역조직화학 연구 및 단백질 정량화는 심각한 상피 중간엽 변형을 시사합니다.
성공적인 니코틴 주입을 보장하기 위해 작업자는 목 뒤의 피부를 잡는 것이 고통스러울 수 있으므로 쥐를 잡는 데 익숙해져야 합니다.
