이 연구는 다음과 같은 과학 연구 보조금(Grants-in-Aid for Scientific Research)의 지원을 부분적으로 받았습니다: (1) 일본 과학 진흥 협회(KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 및 JP22H00494에서 TAK로, JP22H03000에서 M.O.로); (2) 일본의료연구개발기구(AMED; JP21wm0425010 - TAK, JP22dk0207065 - M.O.) (3) 일본 과학 기술 기구 CREST (JPMJCR22N5 to TAK). 연구비 지원 기관은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 어떠한 역할도 맡지 않았다. 영어 편집을 담당해 주신 에디티지(www.editage.jp)에 감사드립니다.

연구 프로토콜은 규슈 대학 윤리 위원회의 승인을 받았으며 헬싱키 선언의 모든 조항을 준수했습니다. 건강한 지원자와 환자를 포함한 모든 참가자로부터 혈액을 분석하고 데이터를 게시하기 위해 서면 동의서를 받았습니다. 재료 및 장비는 재료 표에 나열되어 있으며 용액의 구성은 표 1에 자세히 설명되어 있습니다.
1. 실험을 위한 배지 및 완충액 준비
<ol><li>RPMI-1640에 10% 열불활성화 소 태아 혈청(56°C, 30분) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 분리 배지를 준비합니다.</li>
	<li>염기성 완충액에 0.5% 소 혈청 알부민(BSA) 원액을 보충하여 분리 완충액을 준비하고 여과(0.22μm)를 통해 멸균합니다.</li>
</ol>2. 전혈에서 단핵 세포의 분리
<ol><li>15mL의 밀도 그래디언트 매체를 50mL 밀도 그래디언트 원심분리 튜브에 옮기고 20°C에서 1분 동안 1,000× g 으로 원심분리합니다. 참고: 50mL 밀도 구배 원심분리 튜브당 15mL의 혈액을 분리합니다. 혈액량이 많을 때는 튜브의 수를 늘립니다.</li>
	<li>헤파린 튜브에 수집된 혈액을 반전으로 균질화하고 화재 멸균 핀셋으로 채혈 튜브의 뚜껑을 제거합니다.</li>
	<li>밀도 구배 원심분리 튜브의 밀도 구배 배지에 동일한 부피(10-15mL)의 혈액을 분주합니다.</li>
	<li>원심분리기의 감속 수준을 1단계 중 4단계로 설정하고 실온(RT)에서 1,000 ×g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 알림: 이 감속 속도에서 180× g (1,000rpm)의 회전 속도가 3분 내에 정지합니다.</li>
	<li>50mL 밀도 구배 원심분리 튜브와 동일한 수의 50mL 원심분리기 튜브를 준비하고 각 튜브에 10mL의 PBS(-)를 채웁니다.</li>
	<li>원심분리 후 버피 코트에서 약 1cm 위까지 플라즈마의 최상층을 제거합니다. 알림: 흡입 피펫을 튜브에 수직으로 삽입하고 액체 표면의 중심에서 조심스럽게 흡입합니다. 버피 코트를 방해하지 않도록 과도하게 흡입하지 마십시오.</li>
	<li>50mL 밀도 구배 원심분리 튜브에 남아 있는 모든 상층액을 10mL의 PBS(-)가 포함된 원심분리 튜브로 디캔팅합니다.</li>
	<li>원심분리기의 감속 수준을 3단계 중 4단계로 재설정하고 RT에서 250× g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 이 단계에서 50mL 원심분리기 튜브 1개와 15mL 원심분리기 튜브 2개와 100μm 세포 여과기를 준비합니다.</li>
	<li>원심분리 후 원심분리기의 온도를 4°C로 설정합니다. 원심분리기 튜브 바닥에 빨간색 둘레가 있는 흰색 펠릿을 검색합니다. 흡인으로 상층액을 제거하고 두드려 펠릿을 부드럽게 풉니다.</li>
	<li>화염 멸균 핀셋을 사용하여 50mL 코니컬 튜브에 100μm 세포 여과기를 배치합니다.</li>
	<li>13mL의 분리 배지를 원심분리 튜브 중 하나에 통합하고 내벽을 세척하여 세포를 제대로 수집합니다. 셀 현탁액을 가져와서 나머지 원심분리 튜브를 연속적으로 세척합니다. 모든 튜브에서 세포를 수집한 후 세포 여과기를 통해 세포 현탁액을 여과하여 50mL 원뿔형 튜브로 넣습니다. 알림: 분리 매체는 분리 프로세스 전반에 걸쳐 냉각되어야 합니다(단계 2.11-2.16).</li>
	<li>2.11단계에서 설명한 대로 각 튜브를 13mL의 분리 매체로 다시 세척합니다. 총 26mL의 세포 현탁액을 수집합니다.</li>
	<li>두 개의 15mL 코니컬 튜브에 동일한 양을 분주하고, 세포를 열거하고, 2.16단계에서 격리 완충액의 적절한 농도(총 세포10,7 개당 완충액 60μL)를 계산합니다. 참고: 15mL 원뿔형 튜브는 2.16단계에서 피펫팅할 때 액체 부피가 작고 액체 거품이 쉽게 발생하기 때문에 작업하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>250× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리하는 동안 마그네틱 스탠드(특히 컬럼과 접촉하는 부분)를 70% 에탄올로 철저히 소독하고 벤치에 올려 자연 건조시킵니다. 절연 버퍼를 얼음 위에 유지하십시오.</li>
	<li>흡인으로 상층액을 제거하고(이 단계에서 적혈구가 존재하기 때문에 ~1mm 두께의 빨간색 펠릿을 찾으십시오), 적절한 양의 분리 완충액을 추가한 다음 ~20x 피펫팅하여 펠릿을 부드럽게 풉니다.</li>
</ol>3. CD11b 마이크로비드를 이용한 단핵구 분리
<ol><li>적용 전 10초 동안 Vortex human FcR 차단 시약. 필요한 양의 시약(총 세포 10,7개당 20μL의 FcR 차단 시약)을 통합하고 4°C의 챔버에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>적용하기 전에 CD11b 마이크로비즈를 10초 동안 소용돌이시킵니다. 필요한 양의 시약(총 7 개 세포당 20μL의 CD11b 마이크로비드)을 넣고 4°C 챔버에서 20분 동안 배양하면서 5분마다 손으로 교반합니다.</li>
	<li>배양 후 10mL의 분리 완충액을 추가하고 부드러운 피펫팅으로 현탁시킨 다음 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>원심분리하는 동안 마그네틱 컬럼을 마그네틱 스탠드에 놓고 3mL의 분리 버퍼로 헹굽니다. 알림: 기둥의 자기 부분을 만지지 말고 기둥을 올바르게 배치하십시오. 기둥에 기포가 들어가면 피펫으로 제거하십시오. 격리 버퍼는 분리 프로세스 전반에 걸쳐 냉각되어야 합니다(단계 3.4-3.9).</li>
	<li>흡인으로 원심분리 후 상층액을 제거하고, 1mL의 분리 완충액을 주입하고, 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 다음 현탁액을 컬럼에 적용합니다.</li>
	<li>컬럼 리저버가 비워질 때마다 3mL의 분리 완충액을 추가하여 컬럼을 3번 세척합니다.</li>
	<li>자기 부분을 건드리지 않고 15mL 원뿔형 튜브에 컬럼을 놓습니다. 5mL의 분리 완충액을 컬럼에 통합하고 플런저를 튜브에 삽입하여 컬럼을 통해 액체를 밀어냅니다.</li>
	<li>튜브에 수집된 셀 현탁액을 300× g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 세포를 분리 배지에 재현탁시킵니다. 5단계에서 계산된 셀 수의 ~10~2.13%가 복구되므로 셀 수에 따라 현탁액을 조정합니다. 알림: 절연 매체는 RT에서 사용해야 하며 4°C의 급격한 온도 변화를 피하기 위해 가열하지 않아야 합니다.</li>
	<li>세포를 열거하고 500μL의 세포 현탁액을 40 × 104 cells/mL의 농도로 24웰 플레이트의 각 웰에 분주하고 밤새 배양합니다. 알림: 셀 현탁액은 다른 플레이트에 필요한 조정된 파종 부피에 따라 적절하게 피펫팅해야 합니다. 예를 들어, 12웰 플레이트의 웰 1개에 대해 1mL, 8웰 챔버 슬라이드의 웰 1개에 대해 250μL입니다.</li>
	<li>마지막으로, 시설에서 정한 감염성 폐기물 처리 정책에 따라 오염된 장비를 폐기하거나 소독합니다.</li>
</ol>4. 단핵구에서 iMG 세포 유도
<ol><li>1% 항생제-항진균 용액, 10ng/mL 재조합 인간 GM-CSF 및 100ng/mL 재조합 인간 IL-34를 기저 유도 배지에 보충하여 유도 배지를 준비합니다.</li>
	<li>전날의 파종에서 분리 매체를 유도 매체로 교체합니다. 플레이트를 앞으로 기울이고 파스퇴르 피펫으로 웰 바닥의 앞쪽 가장자리에서 고갈된 매체를 즉시 흡입합니다. 한 번에 최대 1개의 플레이트(= 24웰)의 비율로 매체를 교체하고 즉시 500μL의 유도 매체를 부드럽게 통합합니다. 참고: 이 단계에서는 부착된 단핵구를 선택해야 합니다.</li>
	<li>유도를 완료하기 위해 14일 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>14일 후에 배지를 500μL의 유도 매체로 다시 교체합니다. 그 후, 세포의 유도 후 유지 관리를 위해 유도 매체를 매주 500μL의 새로운 유도 매체로 교체합니다.</li>
</ol>5. 면역세포화학(Immunocytochemistry)
<ol><li>8단계에서 세포로 파종된 3.10웰 챔버 슬라이드에서 배지를 흡인으로 제거하고 PBS(-)로 헹굽니다.</li>
	<li>4% 파라포름알데히드로 RT에서 20분 동안 세포를 고정합니다.</li>
	<li>정착 시약을 제거하고 PBS(-)로 3 x 5분 동안 세포를 헹굽니다.</li>
	<li>RT에서 0.1% Triton X-100을 포함하는 PBS(-)로 세포를 투과시킵니다.</li>
	<li>투과된 세포를 RT에서 1시간 동안 차단 용액(3% BSA/PBS(-))으로 배양합니다.</li>
	<li>4 °C에서 1 차 항체 (Table of Materials)로 세포를 밤새 배양합니다. 참고: 모든 항체는 차단 용액에 희석됩니다.</li>
	<li>PBS(-)로 3 x 5분 동안 세포를 각각 5분 동안 헹굽니다.</li>
	<li>헹굼 된 세포를 RT (Table of Materials)에서 1 시간 동안 적절한 형광 태그 된 2 차 항체로 배양합니다.</li>
	<li>PBS(-)로 세포를 3 x 5분 동안 헹구어 2차 항체를 제거합니다.</li>
	<li>PBS(-)로 희석한 DAPI(1:10,000) 용액으로 RT에서 5분 동안 세포를 배양합니다.</li>
	<li>PBS (-)로 3 x 5 분 동안 세포를 헹굽니다.</li>
	<li>장착 매체를 사용하여 웰을 장착하고 형광 현미경으로 세포를 시각화합니다.</li>
</ol>

인간의 뇌 질환을 연구하기 위한 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 개발

<ol>
	<li>Steiner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+in+the+neurobiology+of+suicide:+elevated+microglial+density+in+schizophrenia+and+depression+is+associated+with+suicide.">Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide.</a> J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).</li><li>Setiawan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+translocator+protein+total+distribution+volume+with+duration+of+untreated+major+depressive+disorder:+a+cross-sectional+study.">Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study.</a> Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).</li><li>Holmes, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+translocator+protein+in+anterior+cingulate+in+major+depression+and+a+role+for+inflammation+in+suicidal+thinking:+a+positron+emission+tomography+study.">Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study.</a> Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).</li><li>Meyer, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+in+psychiatric+disorders:+PET+imaging+and+promising+new+targets.">Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets.</a> Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).</li><li>Ohgidani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+induction+of+ramified+microglia-like+cells+from+human+monocytes:+dynamic+microglial+dysfunction+in+Nasu-Hakola+disease.">Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease.</a> Sci Rep. 4, 4957 (2014).</li><li>Kato, T. 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J., Fourrier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+monocyte-derived+microglia-like+cell+models:+A+review+of+the+benefits,+limitations+and+recommendations.">Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations.</a> Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).</li><li>Lannes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+of+human+microglia+cells+with+Japanese+encephalitis+virus.">Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus.</a> Virol J. 14 (1), 8 (2017).</li><li>Ryan, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+microglia-like+cellular+model+for+assessing+the+effects+of+neurodegenerative+disease+gene+variants.">A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants.</a> Sci Transl Med. 9 (421), 7635 (2017).</li><li>Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+human+microglia+model:+characterization+of+human+monocyte-derived+microglia.">A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia.</a> J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).</li><li>Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HHV-6A+infection+induces+amyloid-beta+expression+and+activation+of+microglial+cells.">HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells.</a> Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104 (2019).</li><li>Ormel, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+the+molecular+phenotype+and+inflammatory+response+of+schizophrenia+patient-derived+microglia-like+cells.">A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells.</a> Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).</li><li>Akiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+HIV-1+intron-containing+RNA+in+microglia+induces+inflammatory+responses.">Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses.</a> J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).</li><li>Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+isolation+techniques+significantly+impact+the+phenotype+of+both+isolated+monocytes+and+derived+macrophages+in+vitro.">Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro.</a> Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).</li><li>Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+human+monocyte-derived+macrophages.">Culture of human monocyte-derived macrophages.</a> Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).</li></ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

iMG 세포를 이용한 분석 기법은 강력한 역번역 연구 도구로 작용할 수 있다 5,6. 충분한 양의 인간 iMG 세포를 생성하기 위해 실험자는 특정 문제를 고려하여 연구를 설계해야 합니다. 인간에서 추출한 혈액 샘플은 매우 민감합니다. 결과적으로, 얻어진 샘플은 신속한 처리와 오염을 방지하기 위한 세심한 취급을 보증합니다. 특히, 혈액 샘플은 채취 후 즉?...

최근 몇 년 동안 뇌 염증은 다양한 뇌 및 신경 정신 질환의 병태 생리학에서 중추적인 역할을 하는 것으로 제안되었습니다. 미세아교세포는 인간의 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층촬영(PET) 기반 생체 영상 기법 1,2,3,4에 의해 주요 면역조절 세포로 각광받고 있습니다. 사후 뇌 및 PET 영상 분석에서 중요한 결과가 밝혀졌습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근 방식은 뇌에서 인간 미세아교세포의 역동적인 분자 활동을 전체적으로 포착하는 측면에서 비효율적입니다. 따라서 분자 및 세포 수준에서 인간의 미세아교세포 기능과 기능 장애를 종합적으로 평가할 수 있는 새로운 전략이 필요합니다.
2014년에 우리는 원래 직접 유도된 미세아교세포(iMG) 세포 5,6을 생산하는 새로운 기술을 설계했으며, 2016년에 인간 유도 만능줄기세포(iPSC) 유래 미세아교세포 유사 세포가 처음 발표되기 전이었습니다7. 단 2주 만에 사이토카인, 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨 34(IL-34)를 최적화하여 인간 말초 혈액 단핵구를 iMG 세포로 전환하는 데 성공했습니다. 우리가 이 기술을 개발했을 때, iPS 세포 또는 섬유아세포로부터 신경 세포를 유도하는 혁신적인 재프로그래밍 방법이 전 세계적으로 막 널리 보급되기 시작했습니다 8,9,10,11. 그러나, 당시에는 iPS 유래 소교세포를 유도하는 방법이 아직 보고되지 않았으며, 인간 체세포 유래 소교세포 모델의 생성이 요구되고 있었다. 대식세포 집락 자극 인자인 GM-CSF 및 IL-34와 같은 사이토카인이 미세아교세포12,13,14,15의 발달 및 유지에 필요한 것으로 보고되었기 때문에 이러한 사이토카인의 조합을 직접 적용하여 혈액 단핵구에서 미세아교세포 모델을 생성할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 마지막으로 GM-CSF와 IL-345를 결합하여 단핵구에서 유래한 미세아교세포 모델을 개발하는 데 성공했다. 또한, 이러한 사이토카인 조합 중 일부는 iPS 세포(7,16)로부터 미세아교세포를 유도하기 위해 사용되며, 미세아교세포 특성을 획득하는데 중요한 인자로 가정된다.
iPSC 방법과 달리 iMG 세포는 유전자 변형이 필요하지 않으며 간단한 화학적 유도로 매우 짧은 시간에 생성할 수 있어 시간과 재정적 비용이 절감됩니다. 또한 iMG 세포는 유전자 재프로그래밍이 필요하지 않기 때문에 iMG 세포는 인간 미세아교세포의 특성뿐만 아니라 상태도 평가할 수 있는 강력한 대리 세포라고 생각합니다. 2014년 iMG 기술에 대한 초기 논문에서 iMG 세포가 단핵구 및 대식세포와 구별될 수 있는 인간 미세아교세포의 표현형을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 예를 들어, iMG 세포는 막관통 단백질 119(TMEM 119) 및 퓨린성 수용체 P2RY12 5,17을 포함한 단핵구 및 전형적인 미세아교세포 마커보다 CX3C 케모카인 수용체 1(CX3CR1) 및 C-C 케모카인 수용체 2형(CCR2)의 과발현 비율을 나타냈습니다. 최근에는 뇌 수술을 받은 동일한 환자에서 말초 혈액 유래 iMG 세포가 잘 알려진 미세아교세포 마커의 유전자 발현 프로필에서 뇌 미세아교세포와 유사하다는 것을 확인했습니다18. iMG 세포는 식세포작용(phagocytosis) 및 사이토카인(cytokine) 생성과 같은 분자 수준의 동적 기능을 분석할 수 있으며, 사후 뇌 연구 및 PET 연구의 단점을 보완할 수 있을 것으로 기대됩니다.
우리는 Nasu-Hakola병 5, 섬유 근육통19, 양극성 장애20,21 또는 Moyamoya병 22로 진단된 환자에서 미세아교세포와 관련된 이전에 알려지지 않은 동적 병태생리학적 메커니즘을 발견했습니다. 더욱이, 우리의 독창적인 방법론에 기초하여, 다양한 실험실에서 iMG 세포(특정 실험실은 이러한 세포에 대한 대체 이름을 지정함)를 중요한 역번역 연구 도구로 사용하였다(23,24,25,26,27). Sellgren et al.은 우리의 권고에 따라 iMG 세포를 성공적으로 생성하고 마이크로어레이 분석을 수행하여 이러한 세포가 인간의 뇌 미세아교세포(23)와 매우 유사하다는 것을 밝혔습니다. 최근에는 RNA 염기서열 분석18을 사용하여 인간 iMG 세포와 뇌 원발성 미세아교세포의 유사성을 확인했습니다.
이 연구는 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 역번역 연구를 촉진하기 위해 인간 말초 혈액에서 iMG 세포를 생성하는 방법론을 문서화하는 것을 목표로 했습니다. 이 기술은 유전자 전달 장치나 숙련된 인력이 부족한 열악한 실험실에서도 짧은 기간 내에 미세아교세포 모델을 쉽게 생성할 수 있는 합리적인 분석 도구로서의 잠재력을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1% Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30-5140-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>09154-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>described as &#34;antibiotic-antimycotic solution&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>described as &#34;basic buffer solution&#34; and used for &#34;isolation buffer&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b MicroBeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130&#8211;049-601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI solution</td>
			<td>DOJINDO</td>
			<td>28718-90-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>14249-24</td>
			<td>described as &#34;PBS (&#8722;)&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>biowest</td>
			<td>S1760-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histopaque-1077</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10771</td>
			<td>described as &#34;density gradient medium&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FcR Blocking Reagent</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130&#8211;059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leucosep</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227290</td>
			<td>described as &#34;density gradient centrifugation tube&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>described as &#34;magnetic column&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>described as &#34;bovine serum albumin (BSA) stock solution&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS MultiStand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>described as &#34;magnetic stand&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253&#8211;84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P10144</td>
			<td>described as &#34;mounting media&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human GM-CSF</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>215-GM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL-34</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>5265-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (pre-supplemented medium)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>61870036</td>
			<td>described as &#34;basal induction medium&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>30264-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-P2RY12 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA014518</td>
			<td>primary antibody, rabbit, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-TMEM119 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA051870</td>
			<td>primary antibody, rabbit, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A-11011</td>
			<td>secondary antibody, rabbit, 1:1000</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering of human blood-induced microglia-like cells for reverse-translational brain research

동물 모델을 사용한 최근 연구는 다양한 신경정신과 및 신체 질환에서 중요한 면역학적 조절인자로서 미세아교세포의 중요성을 강조했습니다. 사후 뇌 분석 및 양전자 방출 단층 촬영 영상은 인간 환자의 미세아교세포 활성화를 평가하는 대표적인 연구 방법입니다. 이 연구 결과는 다양한 신경 정신 질환과 만성 통증을 나타내는 환자의 뇌에서 미세아교세포의 활성화를 밝혔습니다. 그럼에도 불구하고, 앞서 언급한 기법은 단지 미세아교세포 활성화의 제한된 측면의 평가를 용이하게 할 뿐입니다. 
뇌 생검과 유도만능줄기세포 기법 대신, 초기에는 갓 유래한 인간 말초혈액 단핵구에서 직접 유도된 미세아교세포(iMG)를 생성하여 과립구-대식세포 집락 자극 인자와 인터루킨 34를 2주 동안 보충하는 기술을 고안했습니다. 이러한 iMG 세포는 세포 수준 스트레스 자극 후 식세포 용량 및 사이토카인 방출에 관한 동적 형태학적 및 분자 수준 분석을 수행하는 데 사용할 수 있습니다. 최근에는 인간 iMG 세포와 뇌 원발성 미세아교세포의 유사성을 확인하기 위해 종합적인 전사체 분석이 사용되고 있습니다. 
환자 유래 iMG 세포는 인간 뇌의 미세아교세포 활성화를 예측하기 위한 주요 대리 마커 역할을 할 수 있으며, Nasu-Hakola 병, 섬유근육통, 양극성 장애 및 Moyamoya 병 환자에서 이전에 알려지지 않은 미세아교세포의 동적 병태생리를 밝히는 데 도움이 되었습니다. 따라서 iMG 기반 기법은 가치 있는 역번역 도구 역할을 하며 다양한 정신 및 신체 질환에서 미세아교세포의 분자 병태생리를 역학적으로 규명하기 위한 새로운 통찰력을 제공합니다.

In recent years, brain inflammation has been suggested to assume pivotal roles in the pathophysiology of various brain and neuropsychiatric disorders; the microglia have been highlighted as key immunomodulatory cells by human postmortem brain analysis and positron emission tomography (PET)-based bio-imaging techniques1,2,3,4. Postmortem brain and PET imaging analyses reveal significant findings; nevertheless, however, these approaches are inefficient in terms of capturing the dynamic molecular activities of human microglia in the brain in their entirety. Therefore, novel strategies are required to enable the comprehensive evaluation of human microglial functions and dysfunctions at the molecular and cellular levels.
In 2014, we originally engineered a novel technique to produce directly induced microglia-like(iMG) cells5,6, prior to the first publication of human-induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived microglia-like cells in 20167. In just 2 weeks, we successfully converted human peripheral blood monocytes into iMG cells by optimizing the cytokines, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and interleukin 34 (IL-34). When we developed this technique, the innovative reprogramming method of inducing neuronal cells from iPS cells or fibroblasts was just beginning to prevail in the world8,9,10,11. However, at that time, a method for inducing iPS-derived microglial cells had not yet been reported, and the generation of a human somatic cell-derived microglial model was desired. Since cytokines such as GM-CSF and IL-34, macrophage colony-stimulating factor, were reported to be necessary for the development and maintenance of microglia12,13,14,15, we hypothesized that a combination of these cytokines could be applied directly to generate a microglial cellular model from blood monocytes. Finally, we succeeded in developing a model of microglia derived from monocytes by combining GM-CSF and IL-345. In addition, some of these combinations of cytokines are also employed to induce microglia from iPS cells7,16 and are assumed to be an important factor in acquiring microglial characteristics.
In contrast to iPSC methods, iMG cells do not require any genetic modification and can be generated in a very short time by simple chemical induction, resulting in lower time and financial costs. Furthermore, iMG cells do not require genetic reprogramming, so we believe that iMG cells are potent surrogate cells to evaluate not only the traits but also the states of human microglia. In the initial paper on the iMG technique in 2014, we confirmed that iMG cells exhibit a phenotype of human microglia, which can be distinct from monocytes and macrophages. For example, iMG cells exhibited an overexpression ratio of CX3C chemokine receptor 1 (CX3CR1) and C-C chemokine receptor type 2 (CCR2) than monocytes and typical microglia markers, including transmembrane protein 119(TMEM 119) and purinergic receptor P2RY125,17. Recently, we validated that peripheral blood-derived iMG cells resemble brain microglia in their gene expression profile of well-known microglial markers in the same patient who underwent brain surgeries18. The iMG cells can be analyzed for dynamic functions at the molecular level, such as phagocytosis and cytokine production, and are expected to compensate for the disadvantages of postmortem brain research and PET studies.
We have discovered previously unknown dynamic pathophysiological mechanisms involving microglia in patients diagnosed with Nasu-Hakola disease5, fibromyalgia19, bipolar disorder20,21, or Moyamoya disease22. Furthermore, based on our original methodology, various laboratories have employed the iMG cells (certain laboratories have designated alternative names to these cells) as a crucial reverse-translational research tool23,24,25,26,27. Sellgren et al. successfully generated iMG cells in compliance with our recommendations and conducted a microarray analysis, which revealed that these cells closely resemble human brain microglia23. Recently, we confirmed the resemblance between human iMG cells and brain primary microglia using RNA sequencing18.
This study aimed to document the methodology to generate iMG cells from human peripheral blood to facilitate reverse-translational research focused on neuropsychiatric diseases. This technique presents potential as a reasonable analytical tool that can effortlessly produce microglial cellular models in a brief duration, even in ill-equipped laboratories that lack gene transfer apparatus or proficient personnel.

저자 스포트라이트: 신경정신 질환에서 미세아교세포 기능 장애의 역할을 밝히기 위한 유도된 미세아교세포와 유사한 세포 기술

역번역 뇌 연구를 위한 인간 혈액 유도 미세아교세포 유사 세포 엔지니어링

Our lab at Kyushu University aimed to clarify the roles of microglial dysfunction in various neuropsychiatric disorders. We believe that our iMG cell technology will shed new light on microglial dynamic function and dysfunction at the cellular level in human beyond the limitation of human brain analysis, such as postmortem study and also pet brain studies. Even now, animal experiments are essential to clarify the brain pathophysiology of mental disorders, but it is unclear how well rodent data can be applied to human pathophysiology.Our human blood-induced iMG cell technology will this gap between rodent data, clinical data, and microglial function and/or dysfunction. Other human-derived cellular disease model, human iPS cell-derived microglia cells are also developed, which need much time and much money to develop and can assess trait markers but not state markers. The advantage of our iMG method is that it is much simpler, less time-consuming, and cost-effective.We have already revealed several candidate molecular factors by our reverse translational iMG research focusing on neuropsychiatric disorders such as dementia disease, bipolar disorder, fibromyalgia, glioma, and disease. We believe that our iMG cell technology will shed new light on microglial dynamic function and dysfunction at the cellular levels in various neuropsychiatric disorders.

중요한 것은 형태학 및 유전자 발현을 포함하여 iMG 세포의 특성에는 많은 개인 수준 및 타이밍 수준의 이질성이 있다는 것입니다. 특정 개체의 iMG 세포는 수많은 분지 모양을 취하는 반면(그림 1A) 다른 개체에서는 구형 상태를 유지합니다(그림 1B). iMG 특성은 단일 개체 내에서도 다를 수 있으므로 iMG 세포는 질병 상태 바이오마커를 검출하기 위한 중추?...

이 연구는 뇌 염증의 간접 평가를 가능하게 하는 인간 단핵구 유래 미세아교세포(iMG) 세포의 확립을 위한 새로운 접근 방식을 설명합니다. 이는 뇌의 잠재적 염증 및 관련 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 연구에 도움이 될 수 있는 세포 모델을 제시합니다.

Recent investigations employing animal models have highlighted the significance of microglia as crucial immunological modulators in various ...

규슈 대학의 우리 연구실은 다양한 신경 정신 질환에서 미세아교세포 기능 장애의 역할을 명확히 하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 iMG 세포 기술이 사후 연구 및 애완 동물 뇌 연구와 같은 인간 뇌 분석의 한계를 넘어 인간의 세포 수준에서의 미세아교세포 역학 기능 및 기능 장애에 대한 새로운 빛을 비출 것이라고 믿습니다. 지금도 동물실험은 정신질환의 뇌병태생리학을 규명하는 데 필수적이지만, 설치류 데이터가 인간의 병태생리학에 얼마나 잘 적용될 수 있을지는 미지수다.우리의 인간 혈액 유도 iMG 세포 기술은 설치류 데이터, 임상 데이터, 미세아교세포 기능 및/또는 기능 장애 사이의 이러한 격차를 해소할 것입니다. 다른 인간 유래 세포 질환 모델인 인간 iPS 세포 유래 미세아교세포도 개발되고 있으며, 이는 개발하는 데 많은 시간과 비용이 필요하고 형질 마커는 평가할 수 있지만 상태 마커는 평가할 수 없습니다. 우리의 iMG 방법의 장점은 훨씬 간단하고 시간이 덜 걸리며 비용 효율적이라는 것입니다.우리는 이미 치매 질환, 양극성 장애, 섬유 근육통, 신경교종 및 질병과 같은 신경 정신 질환에 초점을 맞춘 역번역 iMG 연구를 통해 여러 후보 분자 요인을 밝혔습니다. 우리는 우리의 iMG 세포 기술이 다양한 신경 정신 질환에서 세포 수준의 미세아교세포 동적 기능 및 기능 장애에 대한 새로운 빛을 비출 것이라고 믿습니다.

engineering-human-blood-induced-microglia-like-cells-for-reverse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Engineering of Human Blood-Induced Microglia-like Cells for Reverse-Translational Brain Research

712 조회수.  Kyushu University. 규슈 대학의 우리 연구실은 다양한 신경 정신 질환에서 미세아교세포 기능 장애의 역할을 명확히 하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 iMG 세포 기술이 사후 연구 및 애완 동물 뇌 연구와 같은 인간 뇌 분석의 한계를 넘어 인간의 세포 수준에서의 미세아교세포 역학 기능 및 기능 장애에 대한 새로운 빛을 비출 것이라고 믿습니다. 지금도 동물실험은 정신질환의 뇌병태생리학?...

비디오: 저자 스포트라이트: 신경정신 질환에서 미세아교세포 기능 장애의 역할을 밝히기 위한 유도된 미세아교세포와 유사한 세포 기술

Recent investigations employing animal models have highlighted the significance of microglia as crucial immunological modulators in various neuropsychiatric and physical diseases. Postmortem brain analysis and positron emission tomography imaging are representative research methods that evaluate microglial activation in human patients; the findings have revealed the activation of microglia in the brains of patients presenting with various neuropsychiatric disorders and chronic pain. Nonetheless, the aforementioned technique merely facilitates the assessment of limited aspects of microglial activation. 
In lieu of brain biopsy and the induced pluripotent stem cell technique, we initially devised a technique to generate directly induced microglia-like (iMG) cells from freshly derived human peripheral blood monocytes by supplementing them with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interleukin 34 for 2 weeks. These iMG cells can be employed to perform dynamic morphological and molecular-level analyses concerning phagocytic capacity and cytokine releases following cellular-level stress stimulation. Recently, comprehensive transcriptome analysis has been used to verify the similarity between human iMG cells and brain primary microglia. 
The patient-derived iMG cells may serve as key surrogate markers for predicting microglial activation in human brains and have aided in the unveiling of previously unknown dynamic pathophysiology of microglia in patients with Nasu-Hakola disease, fibromyalgia, bipolar disorder, and Moyamoya disease. Therefore, the iMG-based technique serves as a valuable reverse-translational tool and provides novel insights into elucidating dynamic the molecular pathophysiology of microglia in a variety of mental and physical diseases.

This study delineates a novel approach for the establishment of human monocyte-derived microglia-like (iMG) cells that enable the indirect assessment of brain inflammation. This presents a cellular model that may be beneficial to research focusing on potential inflammation of the brain and associated neuropsychiatric disorders.

연구

면역학 및 감염병학

Isolation of Mononuclear Cells from Whole Blood to Obtain Induced Microglia-Like Cells for Brain Research

To begin, put 15 milliliters of the density gradient medium in a 15-milliliter centrifugation tube and spin it at 1, 000 G for one minute at 20 degrees celsius. Invert the tube containing human blood collected in heparin, and using fire sterilized tweezers, remove the lid from the blood collection tube. Dispense around 10 to 15 milliliters of blood to the density-gradient medium in the tube.Set the deceleration level of the centrifuge to one and centrifuge the tube with blood at 1, 000 G for 10 minutes at room temperature. Remove the top layer of plasma up to one centimeter above of the buffy coat. Decant the remaining supernatant from the centrifugation tube into another centrifuge tube containing 10 milliliters of PBS.Reset the deceleration level of the centrifuge to three and centrifuge the tube with PBS and supernatant. Aspirate the supernatant and gently tap the tube to loosen the pellet. Next, incorporate 13 milliliters of isolation medium into the centrifuge tube and wash the inner wall to collect the cells properly.Using fire sterilized tweezers, position a 100-micrometer cell strainer on the 15-milliliter conical tube. Then filter the cell suspension through the cell strainer into the 15-milliliter conical tube. Dispense equal amounts of cell suspension into two 15-milliliter conical tubes.Enumerate the cells to calculate the appropriate concentration of isolation buffer. Pellet the cells at 250 G for 10 minutes at four degrees celsius. After removing the supernatant, add the appropriate amount of isolation buffer and pipette around 20 times to loosen the pellet.

뇌 연구를 위한 유도 미세아교세포(induced microglia-like cells)를 얻기 위해 전혈(whole blood)에서 단핵 세포를 분리합니다.

Obtaining Induced Microglia-Like Cells from Whole-Blood Derived Monocytes for Probing Microglial Dynamics in Human Diseases 

To begin, obtain human mononuclear cells from whole blood. Vortex human FcR blocking reagent, and add the required amount of reagent to the cells. Incubate the tube with cells at four degrees Celsius for five minutes.Add 20 microliters of CD11b MicroBeads per 10 to the power of seven total cells, and incubate at four degrees Celsius for 20 minutes. Thoroughly disinfect the magnetic stand with 70%ethanol. After incubation, add 10 milliliters of isolation buffer.Mix, and centrifuge the tube at 300G for 10 minutes at four degrees celsius. Once the stand dries, position the magnetic column on the magnetic stand. After removing the supernatant, add one milliliter of isolation buffer and mix gently with the pipette.Then load the cell suspension onto the column and wash it three times with three milliliters of isolation buffer each time the column reservoir is empty. Place the column in a 15-milliliter conical tube without touching the magnetic part. After adding five milliliters of isolation buffer, push the plunger into the tube to force the liquid out through the column.Centrifuge the cell suspension collected in the tube. Aspirate the supernatant and re-suspend the cells in isolation medium. Following cell counting, aliquot 500 microliters of cell suspension into each well of a 24-well plate, and incubate overnight.To induce microglia-like cells, replace the isolation medium from the seeding of the previous day with an induction medium and incubate the cells for 14 days. The induced microglia-like cells exhibited minute soma bodies and numerous branched collaterals.