Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Resumo

Relógios circadianos funcionam no interior das células individuais, ou seja, são células-autónomo. Aqui, descrevem métodos para a geração de modelos de células autónomas relógio usando não-invasiva, com base em tecnologia de luciferase bioluminescência em tempo real. Células repórter fornecer tratáveis, sistemas modelo funcional para estudar biologia circadiano.

Resumo

Nos mamíferos, muitos aspectos do comportamento e fisiologia, tais como ciclos de sono-vigília e metabolismo do fígado são regulados pela endógenos relógios circadianos (revisado ^1,2). O sistema de cronometragem circadiano é uma rede multi-oscilador hierárquica, com o relógio central, localizado no núcleo supraquiasmático (SCN) a sincronização e coordenação de relógios SCN-extra e periférico em outro lugar ^1,2. As células individuais são as unidades funcionais para a geração e manutenção de ritmos circadianos ^3,4, e estes osciladores de diferentes tipos de tecidos de um organismo a percentagem notavelmente semelhante mecanismo de feedback negativo bioquímico. No entanto, devido a interacções a nível de rede neuronal no SCN e através rítmicos, pistas sistémicos ao nível dos organismos, os ritmos circadianos no nível organismal não são necessariamente células autónoma ^5-7. Em comparação com estudos tradicionais de actividade locomotora in vivo e ex vivo explantes SCN, cell com base em ensaios in vitro permitir a descoberta de células autônomas defeitos circadianos ^5,8. Estrategicamente, baseados em células modelos são mais tratáveis ​​experimentalmente para a caracterização fenotípica e rápida descoberta de mecanismos de clock básico ^5,8-13.

Porque os ritmos circadianos são dinâmicos, medições longitudinais com alta resolução temporal são necessários para avaliar a função do relógio. Em anos recentes, a gravação em tempo real usando a bioluminescência de luciferase do pirilampo, como repórter tornou-se uma técnica comum para o estudo de ritmos circadianos em mamíferos ^14,15, uma vez que permite o exame da persistência e da dinâmica de ritmos moleculares. Para monitorar a célula-autónomos ritmos circadianos de expressão do gene, os repórteres de luciferase pode ser introduzido em células através de transfecção transiente ^13,16,17 ou transdução estável ^5,10,18,19. Aqui descrevemos um protocolo de transdução estável usando lentivírus mediada entrega de genes. Tele sistema vector lentiviral é superior aos métodos tradicionais, tais como a transfecção transiente e transmissão germinal devido à sua eficácia e versatilidade: ela permite a entrega eficiente e a integração estável no genoma do hospedeiro de ambos dividindo e não as células em divisão ^20. Uma vez que uma linha celular repórter é estabelecida, a dinâmica da função de relógio pode ser examinado através da gravação de bioluminescência. Nós primeiro descrever a geração de P (Per2)-D linhas repórter Luc, e em seguida, apresentam dados deste e de outros repórteres circadianos. Nestes ensaios, os fibroblastos 3T3 de rato e células de osteosarcoma humano U2OS são utilizados como modelos celulares. Também discutimos várias formas de utilizar esses modelos de relógio em estudos circadianos. Métodos descritos aqui podem ser aplicados a uma grande variedade de tipos de células para o estudo da base molecular e celular do relógio circadiano, e pode ser útil na resolução de problemas em outros sistemas biológicos.

Protocolo

1. Construção de Lentiviral Repórteres luciferase

A construção repórter de mamífero circadiano geralmente contém uma cassete de expressão no qual um promotor circadiano é fundido com o gene da luciferase. Ambas as estratégias de ligação e de recombinação baseada são comumente usados ​​para a clonagem de DNA. Como um exemplo, aqui descrevemos um método baseado em recombinação clonagem Gateway para gerar um P (Per2)-d repórter Luc lentiviral, em que a luciferase desestabilizado (d Luc) está sob o controle do promotor do rato Per2.

1. A clonagem do promotor Per2. Use PCR para amplificar o fragmento de DNA Per2 promotor de 526 bp a montante do sítio de iniciação da transcrição a partir de um clone BAC Per2 rato ^9-13, utilizando um iniciador directo (5'-CTCGAGCGGATTACCGAGGCTGGTCACG TC-3 ') e um iniciador reverso (5' CTCGAGTCCCTTGCTCGGCCCGTCAC-TTGG-3 '), e do clone em pENTR5'-TOPO vector (Invitrogen) para gerarpENTR5'-P (Per2).
2. Clonagem de d Luc. O Luc d contém o gene da luciferase do pirilampo e de uma sequência PEST C-terminal por degradação de proteínas rápida como anteriormente descrito ^21. Use PCR para amplificar o fragmento de DNA d Luc, e clone em pENTR / D-TOPO vector (Invitrogen) para gerar pENTR / Dd Luc.
3. Construção do vector repórter. Misture os dois plasmídeos pENTR, pENTR5'-P (Per2) e pENTR / Dd Luc, com o vetor de destino lentiviral pLV7-BSD (BSD, blasticidina gene de resistência), e realizar a reação de recombinação usando Clonase para gerar um pLV7-BSD-P (Per2)-d repórter Luc (Figura 1). pLV7-Bsd é uma versão modificada (feito no nosso laboratório) de pLenti6/R4R2/V5-DEST (Invitrogen), em que o vírus da hepatite da marmota pós-transcricionais reguladoras de elementos (WPRE) sequências de ²² foram inseridos imediatamente a jusante da expressão de ca ssette para aumentar a expressão do gene.

2. Produção de Partículas Lentiviral

1. Células de sementes 293T (dia 1)

1. Crescer de rim embrionário humano (HEK) 293T células até à confluência em DMEM 90-100% normal suplementado com FBS a 10% e penicilina-estreptomicina 1x-Glutamina (PSG) em placas de cultura de 10 cm. (Células com crescimento acelerado, com número de passagens baixo são essenciais para transfecção eficiente.)
2. Antes de semear as células para transfecção, revestimento placas de cultura de 6 poços por adição de 1 ml de 0,001% de poli-L-lisina em PBS a cada poço e incubar à temperatura ambiente durante 20 min. Aspirar a solução e lavar uma vez com 1x PBS antes da utilização.
3. Dissociar células 293T com tripsina e de sementes 0,75 x 10 ⁶ células para cada poço das placas pré-revestidas com 2 ml de DMEM regular. Redemoinho as placas cuidadosamente para se obter uma distribuição uniforme de células em cada poço. Crescer as células na incubadora a 37 ° C durante a noite.

tep "> 2 transfecção. Transient via _CaPO4 / precipitação do DNA (dia 2)

1. Observe as células semeadas a partir do dia 1. Celular deve chegar a confluência de 80-90%.
2. Preparar a mistura de transfecção do plasmídeo para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por adição de 2 ug de ADN de um plasmídeo repórter lentiviral (por exemplo, pLV7-P (Per2) d-Luc; Liu lab) e os três vectores de empacotamento (1,3 ug Gag / Pol, 0,5 ug Rev, e 0,7 ug VSVG; Invitrogen). Como controlo, tanto para a transfecção e infecção subsequente, que geralmente incluem um poço adicional na transfecção de um vector lentiviral expressão da GFP, pLV156-CMV-EGFP (Figura 1A), abrigando proteína verde fluorescente melhorada (EGFP), sob o controlo do promotor de CMV como descrito previamente ^20.
3. Adicionar 100 ul de 0,25 M _de CaCl2 (diluído com DNase / RNase DDH ₂ O estoque de 2,5 M) à mistura de plasmídeo no passo 2 e misturar bem. Em seguida adicionar 100 ul de solução de BBS 2x (50 mM BES, 280 mM NaCl, 1,5 mM de Na ₂ HPO _4, pH 6,95) e misturar suavemente mas profundamente. Incubar a mistura de ADN à temperatura ambiente durante 15 min.
4. Enquanto espera, aspirar médio a partir de células 293T e altere a 2 ml de meio fresco. Regressar a placa à incubadora durante pelo menos 10 min para equilibrar o pH do meio antes da transfecção.
5. Adicionar mistura de transfecção a partir do passo 3 para células 293T gota a gota. Placa Mexa suavemente e observar a formação de partículas sob um microscópio. Incubar em _5% de CO2, 37 ° C durante a noite. (Formação de partículas finas de CaPO precipitado ₄ / DNA é crítica para a transfecção eficiente.)

3. Partículas virais de colheita (dias 3-4)

1. Cerca de 16 horas após a transfecção (dia 3), através da qual as células de tempo deve chegar a 100% de confluência, aspirar meio de células e substituir com 2 ml de DMEM fresco regular. Incubar a 37 ° C durante a noite.
2. No dia 4, avaliar a eficiência de transfecção pela observação de expressão EGFP em transfection células de controlo (A eficiência de transfecção de 90-100%, com maior expressão EGFP é uma previsão fiável de uma boa preparação viral.)
3. Recolher o meio contendo segregadas, partículas virais infecciosas. Centrifugar a> 2000 xg durante 5 min para remover residuais células 293T e recolher o sobrenadante contendo vírus. Alternativamente, o meio pode ser limpo com um filtro de membrana de 0,45 um. As partículas virais estão prontos para utilização na infecção.

3. A infecção de células 3T3

1. As células 3T3 de semente (dia 3)

Dividir e número de sementes apropriada (~ 12000) de células 3T3 numa placa de 12 poços para se obter 20-30% de confluência por dia seguinte. Incubar a 37 ° C durante a noite.

2. Infectar as células 3T3 (dia 4)

1. Observe as células semeadas. Confluência de 20-30% (menos do que 50%) é desejado para a infecção.
2. Adicionar polibreno a uma concentração final de 5 ug / ml para o meio recolhido contendo viralpartículas. Misturar bem por pipetagem.
3. Aspirar meio de células 3T3 e adicionar 1 ml da mistura acima viral por poço. Incubar a 37 ° C durante a noite. (Polybrene é utilizado para melhorar a eficiência de infecção, mas não é absolutamente necessário. Como pode ser tóxico para algumas células, o teste prévio é recomendado.)

3. Selecione as células infectadas (dia 5 em diante)

1. Vinte e quatro horas após a infecção, aspirar meio contendo polibreno vírus e de células infectadas, lavar uma vez com PBS 1x e mudar para meio fresco. Incubar a 37 ° C durante a noite para a recuperação e crescimento.
2. Quando confluentes (geralmente 1-2 dias mais tarde), dividir as células e incubar a 37 ° C durante a noite.
3. No dia seguinte meio, aspirado a partir de células (<50% de confluência é desejada) e substitua com meio fresco contendo 10 ng / ml para seleccionar blasticidina para estavelmente transduzidas células. (Blasticidina matar-curva tem de ser determinado empiricamente para uma linha de células particular.)
4. Mudar para meio fresco contendo blasticidina cada 2-3 dias para a selecção contínua de antibiótico-resistentes células que expressam os repórteres de relógio (geralmente 4-6 dias no total).

4. Gravação de bioluminescência de Células Reporter

1. Repórter células de sementes

Propagar células resistentes blasticidina repórter e dividida em placas de cultura de 35 mm. Incubar a 37 ° C até à confluência. Nós normalmente preparar ≥ 3 pratos para cada linha de células repórter em cada condição para fenotipagem circadiano.

2. Sincronização e mudança de meio de gravação

1. Aspirar meio a partir de células confluentes repórter, lavar uma vez com PBS, e substituir com DMEM contendo 10 mM de forskolin (ou 200 nM de dexametasona). Incubar a 37 ° C durante 1 hora, para sincronizar as células. (Alternativamente, as células podem ser sincronizados por ²³ ciclos de temperatura ou de choque de soro ^24.)
2. Enquanto espera, prepare recordeing meio para células 3T3 como se segue: 1x DMEM (HyClone) contendo 10% FBS, 1x pH Pen / Strep / Gln, 1 uM de forscolina, 1 mM de luciferina, 25 mM de HEPES, 7,4. Soro ea concentração de forskolin pode ser determinada empiricamente. No caso de células muito fraca, média livre de vermelho de fenol podem ser usados.
3. No final do tratamento de forscolina, aspirar meio e substituir por meio de gravação feita recentemente.

3. Gravação bioluminescência de células repórter

1. Após a mudança médio, cobrir placas de cultura com 40 milímetros lamínulas estéreis e selo em lugar com graxa de vácuo para evitar a evaporação.
2. Carregar os pratos para o luminómetro LumiCycle, que é mantido no interior de um conjunto de incubadora a 36 ° C sem H ₂ O ou CO _2.
3. Iniciar gravação em tempo real de bioluminescência. Nós normalmente gravar ritmos durante 1 semana, seguido por troca de meio e de gravação contínua para uma segunda semana (ver Savelyev et al. Para mais pormenores) ^25. (Para gravação de 96 nósll, placas Synergy SL2 foi usado como o dispositivo de gravação, ver Discussão 1.1 para detalhes).

5. Análise de Dados e Apresentação

Células repórter facilitar alta resolução de gravação de luminescência quantitativa, fundamental para determinar efeitos fenotípicos sobre a função do relógio circadiano. Para obter parâmetros circadianos, incluindo fase, a duração do período, amplitude, ritmo e taxa de amortecimento, usamos o programa de Análise LumiCycle (Actimetrics) para analisar os dados de bioluminescência ^5,14. Resumidamente, os dados em bruto são de linha de base equipado primeiramente, e da linha de base-subtraídas dados são montados a uma onda seno, a partir da qual os parâmetros são determinados. Para amostras que mostram ritmos persistentes, bondade do ajuste de> 90% é geralmente obtida. Devido à elevada transiente bioluminescência após mudança de meio, que normalmente excluir o primeiro ciclo de análise de dados.

Para a apresentação dos dados, que geralmente traçar dados brutos (bioluminescência, contagens / s) contra time (dias). Quando necessário, os dados de linha de base, podem ser representados subtraídos para comparar a amplitude e fase.

6. Resultados representativos

1. Fase específicos repórteres circadianos

O relógio circadiano baseia-se num mecanismo de feedback negativo bioquímico ^1. O ciclo de realimentação núcleo é constituído de ativadores transcricionais Bmal1 e relógio, e Pers repressores e Crys, que atuam sobre os elementos circadianos E / E'caixa-Enhancer para produzir a expressão do gene rítmica (com fase de manhã, por exemplo, Rev-erb α). O laço núcleo regula e integra pelo menos dois outros circadianos cis-elementos, o elemento de ligação DBP/E4BP4 (D-box, para fase de dia, por exemplo, Per3) eo elemento ROR / REV-ERB ligação (RRE, por fase de noite, por exemplo, Bmal1) ^17. Regulação combinatória por múltiplos elementos circadianos pode gerar novas fases intermediárias. Por exemplo, a transcrição Cry1ção é mediada por todos os três elementos circadianos (isto é, os elementos E, / E'-box e D-box no promotor e RREs no primeiro intrão do gene Cry1), dando origem ao distinto Cry1 fase noite tempo ^13.

Com base nestes mecanismos de regulação dos genes, foram geradas quatro construções repórter diferentes: P (Per2) d-Luc e P (Cry1)-D repórteres Luc contendo tanto E / E'-caixa e da caixa D-elementos na região reguladora ^{17, 26,27;} P (Cry1) - Intron-d Luc representando regulação combinatória por todos os três elementos (ou seja, E / E'-box, D-box, e RRE) ^13,17, e P (Bmal1)-d Luc regulada exclusivamente por RRE ^9,17,19,21. Introduzimos estas repórteres em células 3T3 para produzir as fases antecipadas distintos de expressão repórter (Figura 2).

2. Knockdown do gene através de RNAi e farmacologicamente active compostos

Quando a eficiência de transfecção é elevada, siRNA sintético pode ser transientemente transfectados para células de derrubar a expressão do gene. Quando a transfecção é tecnicamente difícil, um vector de expressão podem ser estavelmente shRNA transduzida em células por meio de infecção por lentivírus, de modo a que shRNA produzido pela célula é processada para siRNA para knockdown do gene (KD). Apresentamos aqui os efeitos de KD Cry1 e cry2 genes utilizando siRNA em células U2OS (Figura 3A) e em células 3T3 shRNA, utilizando um vector de expressão de Gateway pLL3.7 ⁹ (Figura 3B). Além de células 3T3, o modelo U2OS tornou-se outro modelo de relógio proeminente celular em grande parte porque ele atende aos requisitos fundamentais para high-throughput screening de bibliotecas disponíveis comercialmente siRNA humanos (por exemplo, origem humana, capaz de gerar fortes ritmos circadianos, função validada de todos os conhecidos genes do relógio, e passíveis de transfecção altamente eficiente egravação de luminescência quantitativa). Em ambos os tipos de células, RNAi mediada KD resultou em fenótipos de relógio consistentes com knockout rato anterior (KO) e estudos celulares KD ^5,10,11,28. Por exemplo, Cry1 KD duração do período diminui e reduz a persistência do ritmo, enquanto cry2 KD prolonga período. Além disso, pequenas moléculas seleccionadas podem ser utilizadas para farmacologicamente alvo e a função da proteína perturb (Figura 3C).

Figura 1. O lentivírus mediada por sistema de entrega de genes. (A) Diagrama esquemático de dois P lentiviral (Per2)-D vetores repórter Luc e uma CMV-EGFP construir. Apenas a região para a integração no genoma da célula hospedeira é mostrado. Em ambas as construções repórter, a transcrição de d Luc está sob o controlo directo do promotor Per2. No pLV7-BSD-P (Per2)-d Luc vetor (recombinação baseada clonagem), um gene de resistência à blasticidina coexpressas (BSD) facilita a selecção de células infectadas. No pLV156-P (Per2) d-Luc vector (ligadura baseado clonagem), tradução EGFP é mediada por um local interno de entrada do ribossoma (IRES) a jusante da d Luc, permitindo por meio de observação visual e triagem por FACS de células infectadas. Além disso, um promotor de SV40 / terminador (P / T), é usado como isolante (ver discussão 1.3). No vector de controlo CMV-EGFP, expressão EGFP está sob controle de um promotor de CMV forte. (B) as imagens fluorescentes de GFP-transfectadas e infectadas que expressam as células. Tipicamente, conseguimos alta eficiência tanto na transfecção transitória de células 293T e na infecção por lentivírus de linhas de células do nosso interesse, como indicado pela expressão de GFP nestas células. para ver figura maior .

Figura 2. Fase a expressão específica de repórteres em células 3T3 de bioluminescência Os vectores lentivirais repórter utilizados nesta experiência são pLV7-Bsd-P (Per2) d-Luc, P (Cry1) d-Luc, P (Cry1) -. Intron-d Luc, e P (Bmal1) d-Luc. Cada repórter apresenta uma fase distinta de oscilação, como indicado pelas setas. Enquanto o Per2 e Cry1 bioluminescência unidade promotores de pico na manhã de dia-fases e do promotor na fase Bmal1 noite, regulação combinatória pelo P (Cry1) - Intron abrigar E-box, D-box, e elementos RRE confere fase noite de bioluminescência de pico . Clique aqui para ver maior figura .

Figura 3. Perturbação genética e farmacológicas dos ritmos circadianos em células de bioluminescência repórter. (A) Efeitos de Cry1 e cry2 knockdown por siRNAs sobre ritmos celulares de células repórter U2OS. O luminómetro LumiCycle foi utilizado para a gravação de bioluminescência de células em pratos de 35 mm. A Figura é adaptado de Referência n º 10, com a permissão da Elsevier (2009). (B) Efeitos da cry2 knockdown por shRNAs sobre ritmos celulares de células repórter 3T3. Um vector de Gateway pLL3.7 contendo uma cassete de U6-shRNA foi usada para knockdown cry2 gene. shRNA2 tem uma eficiência melhor do que knockdown shRNA1 como determinado por análise de Western blot (dados não mostrados). Um luminómetro Synergy foi utilizado para a gravação de bioluminescência de células numa placa de 96 poços. As configurações de gravação são as seguintes:. Incubadora de temperatura, 33 ° C, o tempo de integração de 15 segundos, o tempo de intervalo, 30 min (C) Efeitos de inibidores de moléculas pequenas em celritmos intracelulares de células repórter U2OS. Chir99021 Roscovitina e são inibidores dirigidos contra a GSK-3 e CDK, respectivamente. O sistema ViewLux (Chir99021 ensaio) e um luminómetro Tecan (Roscovitina ensaio) foram utilizadas para as gravações de bioluminescência de células em 384 poços. Figura é adaptado de Referência # 19 (Copyright 2008 Academia Nacional de Ciências dos EUA). Clique aqui para ver maior figura .

Discussão

1. Modificações protocolo atual

1.1 dispositivos de gravação e considerações de rendimento

Devido à sua disponibilidade comercial, a LumiCycle (Actimetrics) tornou-se o dispositivo de luminimetro mais comumente utilizado automatizado para gravação em tempo real ^{4,5,9,19,29-31.} O LumiCycle emprega tubos fotomultiplicadores (PMT), como detectores de luz, que proporcionam sensibilidade extremamente elevada e baixo ruído ^14, e, por consegui...

Materiais

Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comentários
DMEM	HyClone	SH30243FS	Para o crescimento celular normal
DMEM	Invitrogen	12100-046	Para luminometria
FBS	HyClone	SH3091003
Pen / Strep / Gln (100x)	HyClone	SV3008201
B-27	Invitrogen	17504-044
D-luciferina	Biosynth	L-8220
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Polybrene	Millipore	TR-1003-G
Forskolin	Sigma	F6886
Todos os outros produtos químicos	Sigma
			Equipamento
De cultura de tecidos incubadora			5% de CO2 a 37 ° C
Capuz de cultura de tecidos			BSL-2 certificado
Light & fluorescente microscópio			O contraste de fase opcional
LumiCycle	Actimetrics