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Method Article
* Estes autores contribuíram igualmente
Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.
Um objetivo central da mechanobiology é entender o efeito recíproco de estresse mecânico em proteínas e células. Apesar de sua importância, a influência do estresse mecânico na função celular é ainda mal compreendida. Em parte, essa lacuna de conhecimento existe porque alguns ferramentas permitem a deformação simultânea de tecidos e células, imagens da atividade celular em animais vivos e eficiente restrição da motilidade em organismos-modelo caso contrário altamente móveis, tais como o nematódeo Caenorhabditis elegans. O pequeno tamanho da c. elegans -los faz um excelente partido para dispositivos de microfluídica-com base em pesquisa, e foram apresentadas soluções para imobilização usando dispositivos microfluídicos. Embora estes dispositivos permitem imagens de alta resolução, o animal é totalmente envolto em polydimethylsiloxane (PDMS) e vidro, limitando o acesso físico para entrega de força mecânica ou eletrofisiológicas gravações. Recentemente, criamos um dispositivo que integra actuadores pneumáticos com um design de captura compatível com microscopia de fluorescência de alta resolução. O canal de atuação é separado pelo canal da interceptação de verme por uma fina membrana PDMS. Este diafragma é desviada para o lado de um verme aplicando pressão de uma fonte externa. O dispositivo pode direcionar os neurônios mechanosensitive individuais. A ativação desses neurônios é fotografada em alta resolução com indicadores de cálcio geneticamente codificado. Este artigo apresenta o método geral usando cepas de c. elegans , expressando o indicador de atividade de cálcio sensíveis (GCaMP6s) em seus neurônios receptores de toque (TRNs). O método, no entanto, não está limitado aos TRNs nem aos sensores de cálcio como uma sonda, mas pode ser expandido para outras células mecanicamente sensíveis ou sensores.
O sentido do tato fornece animais com informações cruciais sobre seu ambiente. Dependendo da força aplicada, o toque é percebido como inócuo, prazeroso ou doloroso. A deformação do tecido durante o toque é detectada pelas células especializadas Mecanorreceptor incorporadas na pele que expressam proteínas do receptor, mais comumente canais iônicos. As etapas ligando a percepção da força para ativação de canal de íon durante o toque e a dor não são totalmente compreendidas. Menos ainda se sabe sobre como o tecido da pele filtra deformação mecânica e se mecanorreceptores detectam alterações na tensão ou stress1,2,3. Esta lacuna na compreensão decorre, em parte, a falta de ferramentas adequadas para aplicar estímulos mecânicos precisos para a superfície da pele de um animal vivo enquanto observa as respostas a nível celular. Considerando que a microscopia de força atômica tem sido amplamente utilizada para aplicar e medir forças em células isoladas de4,5 e também para ativar receptores Piezo1 em vida células6, experimentos semelhantes usando animais vivos, especialmente C. elegans, têm sido notoriamente desafiadora devido a mobilidade intrínseca do assunto. Tradicionalmente, este desafio é contornado usando cola de cianoacrilato de veterinária - ou -grau cirúrgico para imobilizar animais individuais em ágar almofadas1,7,8,9. Esta abordagem tem sido produtiva, mas tem limitações relacionadas com a habilidade necessária para a imobilização por colagem e superfície do agar macio na conformidade mecânica. Uma estratégia de microfluídica é uma alternativa gratuita que evita algumas das complicações ligadas à colagem.
O nemátodo c. elegans é um organismo modelo genético cujo sistema nervoso completamente mapeado que, devido ao tamanho do animal, é uma boa opção para tecnologia microfluídica. Oferta de dispositivos baseados em microfluídica a vantagem que os animais caso contrário extremamente móveis podem ser contidos durante a execução de imagens de alta resolução e entrega de estímulos neuro-moduladora relevantes. Com a ajuda de microfluidic tecnologias, vivem animais podem ser imobilizadas sem dano10,11, permitindo o monitoramento da atividade comportamental ao longo da vida inteira de12,13 e de alta resolução imagem de atividade neuronal14,15,16,17. Além disso, muitos neurônios Mecanorreceptor necessários para o sentido de toque e a dor pode ser caracterizado em sua fisiológicas1,8, mecânica4,18,19e molecular nível20,21,22.
C. elegans sentidos suaves estímulos mecânicos para sua parede do corpo usando seis TRNs, três dos quais inervam do animal anterior (ALML/R e AVM) e três dos quais inervam posterior do animal (PLML/R e PVM). As moléculas de canal de iões necessárias para transducing uma força aplicada em um sinal de bioquímico têm sido muito estudadas em seu TRNs8. Este artigo apresenta uma plataforma microfluidic23 que permite que os investigadores a aplicar forças mecânicas precisas na pele de um imobilizado c. elegans lombriga, ao ler a deformação de seus tecidos internos pela imagem latente ótica. Além de apresentar estímulos mecânicos bem definidos, transientes de cálcio podem ser gravados em neurônios Mecanorreceptor com resolução subcellular e correlacionados com características morfológicas e anatômicas. O dispositivo consiste de um canal central de interceptação que mantém um único animal e apresenta sua pele ao lado de seis canais de acionamento pneumático (Figura 1 e Figura 2). Os seis canais estão posicionados ao longo do canal de armadilhas para entregar a estímulos mecânicos para cada um dos seis TRNs do worm. Estes canais são separados da câmara de captura por diafragmas PDMS finos, que podem ser conduzidos por uma fonte de pressão do ar externo (Figura 1). Nós calibrado a deflexão em relação a pressão e fornecer as medições neste artigo. Cada atuador pode ser abordada individualmente e usado para estimular um Mecanorreceptor de escolha. A pressão é fornecida usando uma bomba de pressão piezo-driven, mas qualquer dispositivo alternativo pode ser usado. Nós mostramos que o protocolo de pressão pode ser usado para ativar TRNs na vivo e demonstrar o funcionamento dispositivos adequados para entrega de estímulos mecânicos para adultos c. elegans, carregar animais adultos em dispositivos, realizando a imagem latente de cálcio experiências e analisando os resultados. Fabricação de dispositivo consiste de duas etapas principais: 1) fotolitos para fazer um molde de SU-8; e 2) PDMS para tornar um dispositivo de moldagem. Por uma questão de brevidade e clareza, os leitores são referidos anteriormente publicados artigos e protocolos24,25 para obter instruções sobre como produzir os moldes e dispositivos.
1. dispositivo fabricação
2. preparação do microscópio
Nota: Animais transgénicos: expressar um indicador de cálcio como GCaMP6s28 ou outra sonda de atividade geneticamente codificado no neuron(s) de interesse (por exemplo, TRN); co expresse uma proteína fluorescente independente de atividade emitem num comprimento de onda diferente para corrigir pequeno lateral e artefatos de movimento fora de foco que surgem devido à estimulação mecânica. O software de análise automatizada faixas e compensa o movimento induzido por alterações na intensidade da sonda atividade. O worm cepas GN69223 (ou AQ323629) express GCaMP6s (ou GCaMP6m) e o tagRFP de cálcio independente sob o controle do promotor do mec-7. Além disso, o GN692 contém a mutação lite-1(ce314), que impede a ativação do TRNs devido ao sensor de luz azul lite-130 durante a excitação da fluorescência GCaMP6s23.
3. animal preparação
4. análise
SU-8 litografia e colagem de Chip
O protocolo de litografia e moldagem de PDMS sigam os procedimentos padrão. Detalhes podem ser encontrados em outros lugares23,24,25,26. O PDMS deve descascar fora a hóstia sem problemas após a cura. Se os recursos de SU-8 arrancar durante o descascamento de PDMS, ou a camada de aderência de SU-8 ou a sil...
Este protocolo demonstra um método de distribuição precisa estimulação mecânica na pele de uma lombriga, presa em um chip microfluidic. Destina-se a facilitar a integração dos estímulos físicos para responder às perguntas biológicas e visa agilizar a pesquisa de mechanobiology em laboratórios biológicos. Esse método amplia anteriores ensaios para avaliar a função dos neurônios mechanosensory em c. elegans. Técnicas quantitativas e semi-quantitativa anteriores medido forças1<...
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez para apoiar no projeto de dispositivo e geração de animais mutantes. Esta pesquisa foi apoiada por subsídios de NIH R01EB006745 (a BLP), R01NS092099 (para MBG), K99NS089942 (a MK), F31NS100318 (a ALN) e recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação (CEI), sob o Horizonte 2020 pesquisa e inovação da União Europeia (do programa Convenção de subvenção n. º 715243 para MK).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chrome mask | Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
Chrome mask | Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/) | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
Chrome mask | Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/ | 5'', designed in AutoCAD (Autodesk, Inc.) | |
4'' Silicon wafer (B-test) | Stanford Nanofabrication Facility | ||
SU-8 2002 | MicroChem | ||
SU-8 2050 | MicroChem | ||
Spin-coater | Laurell Technologies | WS-400BZ-6NPP/LITE | |
Exposure timer | Optical Associates, Inc | OAI 150 | |
Illumination controller | Optical Associates, Inc | 2105C2 | |
SU-8 developer | MicroChem | ||
2-Propanol | Fisher Scientific | A426F-1GAL | |
Acetone | Fisher Scientific | A18-4 | |
Trichloromethylsilane (TCMS) | Sigma-Aldrich | 92361-500ML | Caution: TCMS is toxic and water-reactive |
Sylgard 184 Elastomer Kit | Dow Corning | PDMS prepolymer | |
Biopsy punch, 1 mm | VWR | 95039-090 | |
Oxygen Plasma Asher | Branson/IPC | ||
Small metal tubing (0.635 mm OD, 0.4318 mm ID, 12.7 mm long); gage size 23TW | New England Small Tube Corporation | NE-1300-01 | |
Nalgene syringe filter, 0.22 μm | Thermo Scientific | 725-2520 | to filter all solution, small particles would clog the chip |
Polyethylene tubing; 0.9652 mm OD, 0.5842 mm ID | Solomon Scientific | BPE-T50 | |
Syringe, 1 ml | BD Scientific | 309628 | for worm trapping and release |
Syringe, 20 ml | BD Scientific | 309661 | for gravity-based flow |
Gilson Minipuls 3, Peristaltic pump | Gilson | to suck solutions and worms out of the chip | |
Microfluidic flow controller, equipped with 0–800 kPa pressure channel | Elveflow | OB1 MK3 | pressure delivery |
Water-Resistant Clear Poly- urethane Tubing, 4 mm ID and 6 mm OD | McMaster-Carr | 5195 T52 | connection from house air to pressure pump |
Water-Resistant Clear Polyurethane Tubing, 2.6mm ID and 4mm OD | McMaster-Carr | 5195 T51 | connect pressure pump to small tubng |
Push-to-Connect Tube Fitting for Air | McMaster-Carr | 5111K468 | metric - imperial converter |
Straight Connector for 6 mm × 1/4″ Tube OD | McMaster-Carr | 5779 K258 | |
Leica DMI 4000 B microscopy system | Leica | ||
63×/1.32 NA HCX PL APO oil objective | Leica | 506081 | |
Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT digital CMOS camera | Hamamatsu | C11440-42U | |
Lumencor Spectra X light engine | Lumencor | With cyan and green/yellow light source | |
Excitation beam splitter | Chroma | 59022bs | in the microscope |
Hamamatsu W-view Gemini Image splitting optics | Hamamatsu | A12801-01 | to split green and red emission and project them on different areas on the camera chip |
Emission beam splitter | Chroma | T570lpxr | in the image splitter |
Emission filters GCamp6s | Chroma | ET525/50m | in the image splitter |
Emission filters mCherry | Chroma | ET632/60m | in the image splitter |
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