Medição da dinâmica do microtúbulo girando microscopia do disco em fusos mitocticos monopolares

Resumo

Aqui apresentamos um método robusto e detalhado de análise da dinâmica dos microtúbulos em células sincronizadas em prometaphase usando microscopia confocal de disco giratório de células vivas e processamento de imagem baseado em MATLAB.

Resumo

Descrevemos uma modificação de um método estabelecido para determinar a dinâmica dos microtúbulos nas células vivas. O protocolo é baseado na expressão de um marcador geneticamente codificado para as extremidades positivas dos microtúbulos (EB3 rotulado com proteína fluorescente tdTomato) e imagens de células vivas de alta velocidade, alta resolução, usando microscopia confocal de disco giratório. A sincronização do ciclo celular e o aumento da densidade de microtúbulos são alcançados inibindo a separação centrosomal em células mitocômicas, e a análise do crescimento é realizada usando software u-track de código aberto. O uso de uma proteína fluorescente brilhante e em vermelho, em combinação com o menor poder laser e o tempo de exposição reduzido necessário para a microscopia de disco giratório, reduzem a fototoxicidade e a probabilidade de artefatos induzidos pela luz. Isso permite a imagem de um número maior de células na mesma preparação, mantendo as células em um meio de crescimento condições de cultura padrão. Como a análise é realizada de forma automática supervisionada, os resultados são estatisticamente robustos e reprodutíveis.

Introdução

Microtubules (MTs) são estruturas altamente dinâmicas encontradas em praticamente todas as células eucarióticas e em algumas bactérias¹. Juntamente com a actina e filamentos intermediários, eles esculpem o citoesqueleto^2,3. Divisão celular^4,transporte de^{moléculas 5,}flagelar batendo^6,a sensação do ambiente circundante através do clácia primário⁷, audição (kinocilium)^8,9,embrionênese^10,11,12, invasão e metástase^13,14,e até mesmo formação de memória^15,16,17,18, e muitos outros processos dependem principalmente de MTs. A participação de MTs em todos esses eventos seria impossível sem sua notável capacidade de alternar rapidamente entre crescimento (polimerização) e encolhimento (despolimerização). Esta propriedade é descrita como instabilidade dinâmica^19. A dinâmica do MT é alterada em muitas condições patológicas^20,21,22. Assim, determinar a natureza desta propriedade pode ajudar a compreender mecanismos da doença e subseqüentemente seu tratamento.

Uma longa lista de métodos foi desenvolvida para a análise da dinâmica MT, a maioria dos quais são baseados em técnicas de imagem²³. Inicialmente, microscópios de luz de campo largo foram utilizados para observar a formação de polímeros de tubulina in vitro²⁴. A descoberta de proteínas end-binding (EB) que se coletam em MT plus-ends e o desenvolvimento de métodos para rotular fluorescentemente proteínas possibilitou observar o comportamento das MTs diretamente em células vivas com amplo campo e microscópios de fluorescência confocal^25,26,27. Uma proteína EB é a proteína de ligação final 3 (EB3)^28; expressando e rastreando eB3 com uma proteína fluorescente, as taxas de montagem mt plus-end podem ser determinadas^29,30.

A microscopia de fluorescência da exploração a laser confocal (CLSM) é frequentemente usada para acompanhar a dinâmica do MT. No entanto, esta técnica de imagem representa um alto risco de fototoxicidade e fotobranqueamento, dois processos indesejáveis para células vivas e imagens de amostra dim³¹. A fim de obter uma melhor relação sinal-ruído, a potência do laser e a duração da exposição devem ser altas o suficiente, sem danificar as amostras, e isso requer sacrificar a resolução em troca de velocidade. Uma alternativa adequada ao CLSM é a microscopia de disco giratório^32. Esta modalidade de imagem é baseada no uso de um disco Nipkow³³, que consiste em um disco em movimento com uma matriz de furos, e funciona de forma equivalente a muitos microscópios CLS imagens da mesma amostra simultaneamente³⁴. Portanto, a luz do laser iluminará várias regiões da amostra simultaneamente, mas manterá a natureza confocal. O disco nipkow, portanto, permite a obtenção de imagens semelhantes ao CLSM, mas mais rápido e usando menos energia a laser. O disco Nipkow foi ainda melhor pelo Yokogawa Electric, que introduziu um segundo disco com uma variedade de microlentes sobre ele que individualmente direcionar a luz em um pinhole respectivos, reduzindo ainda mais fototoxicidade e fotobranqueamento³⁵. Assim, a microscopia de digitalização a laser de disco giratório tornou-se um método de escolha para imagens de células vivas, e torna possível obter imagens com alta relação sinal-ruído em alta velocidade^31,36, o que é crucial para resolver sinais como os das extremidades de rápido crescimento do MT.

A dinâmica do MT difere temporariamente. Por exemplo, as MTs mitocôticas são mais dinâmicas do que as^{interfases 37,38.} Da mesma forma, diferenças na taxa de crescimento e encolhimento têm sido observadas mesmo dentro da mesma fase do ciclo celular, como a mitose^39,40. Portanto, para evitar a coleta de dados falsos, a medição da dinâmica do MT deve ser limitada a uma janela de tempo estreita durante o ciclo celular. Por exemplo, a medição da dinâmica mt na prometaphase pode ser alcançada através do tratamento das células com dimenastron (DME), um análogo monastrol que inibe o motor kinesin Eg5⁴¹ e impede a formação do fuso mitomático⁴². Inibição de células em prometaphase com DME inibidor eg5 e outros derivados monastrois não afeta a dinâmica MT^43,44,45, o que torna DME uma ferramenta útil para estudar a dinâmica mt tanto em células fixas e vivas⁴⁴.

Aqui combinamos o método de análise de dinâmica MT em células prometaphase descritas por Ertych et al.⁴⁴ com imagens de disco de fiação dupla. Este método permite a medição da dinâmica mt em células prometaphase coletadas a partir de um único plano focal com uma maior taxa de imagem, mas sem fotobranqueamento e fototoxicidade mínima. Além disso, como repórter fluorescente, usamos proteína fluorescente de tomate tandem dimer (tdTomato), que melhorou o brilho e a fotostabilidade em comparação com a proteína fluorescente verde (EGFP) e está animada com luz de energia mais baixa⁴⁶. Portanto, tdTomato requer menos energia laser para excitação e é menos fototóxico. Ao todo, melhoramos ainda mais o método, reduzindo a fototoxicidade e melhorando a resolução e pós-processamento necessários para a análise da dinâmica do MT. Além disso, criamos uma base para futuras modificações do método, combinando-o com outras técnicas de sincronização.

Protocolo

1. Semeadura de células HeLa

1. Prepare 2 mL de 5 μg/mL solução de fibronectina em soro fisiológico tampão de fosfato (PBS) e adicione 450 μL dele em cada poço de um coverslip de 4 poços com câmara (#1,5). Incubar o slide por 15 min a 37 °C e 5% CO₂.
2. Enxágüe células HeLa de crescimento assíncrono com a soro-sinodiada de Dulbecco (DPBS) e incubada com trippsina-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) por 5 min a 37 °C. Pare a reação enzimática pela adição do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 médio complementado com 10% de calor inativado soro de vitela fetal (FCS) em 3:1 (v:v) relação de trippsina adicionada-EDTA.
   Nota: As células HeLa foram mantidas no rpmi 1640 médio complementado com 10% de calor inativado FCS em 37 °C e 5% CO₂ e foram rotineiramente passados uma vez que atingiu 80-90% de confluência, conforme descrito acima.
3. Determine a concentração celular usando uma câmara de Neubauer. Misture um alíquota de 50 μL da suspensão celular com trippan azul em 1:1 (v:v) relação, suspender e transferir 10 μL da suspensão para a câmara. Conte apenas as células azul-negativas trippan dentro dos quatro grandes quadrados (para detalhes ver Phelan et al.⁴⁷). Derivar a concentração celular do número de células contados usando a seguinte fórmula:
   
4. Pelotas as células por centrífuga a 300 x g para 2 min. Resuspende com RPMI 1640 fresco, a fim de obter 1 x 10⁶ células / mL.
5. Retire a fibronectina do coverslip com câmara, lave os poços duas vezes com DPBS, e sementes 50.000 células por poço.
6. Devolva o coverslip com câmara com as células para a incubadora e cultivá-los por 24 h a 37 °C e 5% CO₂.

2. Expressão de pEB3-tdTomato em células HeLa

1. Prepare um tubo de microcentrírígio de 1,5 mL. Para cada tubo, diluir 2 μg de pEB3-tdTomato⁴⁸ com buffer de transfecção (produto sintético em solução aquosa) para um volume final de 396 μL.
2. Adicione 4 μL de reagente de transfecção (não lipídico, contendo polietilenomina) ao primeiro tubo, e vórtice a mistura imediatamente por exatamente 10 s.
3. Gire brevemente para baixo o tubo com uma microcentrífuga e incubar à temperatura ambiente (RT) por 10 min.
4. Retire as células HeLa da incubadora. Dropwise, adicione 100 μL da mistura de transfecção para cada poço de um coverslip 4 bem com câmara, e retornar as células para a incubadora.
5. Após 4 h de incubação a 37 °C e 5% CO_2,complemente as células com médio de crescimento fresco e incubam por pelo menos 24 h a 37 °C e 5% CO₂.
   Nota: É necessário otimizar as condições de transfecção para cada tipo de célula. Os níveis de expressão precisam ser baixos o suficiente para permitir a identificação de fins de crescimento de MT único. Alternativamente, uma linha celular expressando eb3-tdTomato pode ser usado nos experimentos; isso reduziria a variabilidade nos níveis de expressão de EB3-tdTomato entre as preparações e entre as células da mesma preparação⁴⁹.

3. Sincronização e imagens de células vivas de células HeLa expressando pEB3-tdTomato- expressando células HeLa

1. Prepare uma solução de 2,5 μM de dimenastron (DME) em fenol-vermelho livre Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complementada com 10% FCS e 2 mM L-glutamina ou uma oferta alternativa de glutamina.
2. Substitua o meio de crescimento no coverslip com câmara com 500 μL do meio de crescimento contendo 2,5 μM DME e incubar as células em 37 °C e 5% CO₂.
3. Após 3,5 h de incubação com DME, transfira as células para o microscópio, monte o coverslip com câmara em uma câmara ambiental com painéis escuros para imagem a 37 °C e 5% CO_2,e incubar ainda mais até que o tempo total de incubação seja de 4 h.
   Nota: A manutenção da temperatura a 37 °C sem flutuação é crucial para o experimento.
4. Realize a imagem de lapso de tempo em um microscópio invertido equipado com um objetivo de imersão de óleo 100x 1.49 N.A., um sistema confocal de disco giratório duplo e um sistema de foco automático confiável para manutenção contínua do plano focal. Defina os parâmetros de imagem da seguinte forma.
   Nota: Usamos uma câmera de dispositivo acoplado a carga multiplicadora de elétrons (EM-CCD).
   1. Para a excitação eb3-tdTomato, use uma linha laser de 561 nm com 200 ms tempo de exposição. Colete a luz emitida através de um bandpass quádruplo (405, 488, 561, 640 nm) espelho dicroico e um filtro de emissão de 600/52 nm.
      Nota: O poder do laser pode ser ajustado para cada pilha imaged para impedir a saturação da imagem. Em todos os filmes de lapso de tempo dado aqui o poder laser foi definido como 5,3 mW.
   2. Encontre uma célula em profase e foco no z-avião correspondente ao centro do eixo mitomótico monopolar. Adquirir imagens a cada 0,5 s ao longo de um total de 1 min, sem binning e sem iluminação entre as exposições.

4. Análise da dinâmica MT usando U-Track v2.2.0

1. Para analisar a dinâmica mt um software de ambiente de computação numérica é necessário (por exemplo, MATLAB).
   Nota: A compreensão básica do software é suficiente para a análise. Material de ajuda abrangente e tutoriais estão disponíveis no site do desenvolvedor (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
2. Baixe (https://github.com/DanuserLab/u-track) e instale o software u-track v2.2.0 de código aberto seguindo as instruções detalhadas dadas no arquivo "Readme_u-track.pdf"^50,51,52.
3. Lance o software de análise numérica e adicione a pasta U-Track v2.2.0 com subdobras no caminho de pesquisa de software.
4. A partir da chamada janela de comando "filmeSelectorGUI". Isso abre uma janela de diálogo a partir da qual os arquivos brutos gerados pelo software de aquisição de imagem no microscópio podem ser importados(Figura Suplementar 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4).
   Nota: O software U-Track é compatível com outros formatos de dados de imagem. Ele usa bio-formatos, que reconhece diferentes formatos de dados de ciência^{si vida 53}.
5. O tamanho de cada imagem é lido a partir dos metadados automaticamente. Digite manualmente a abertura numérica do objetivo (neste caso 1,49) e o intervalo de tempo (0,5 s) utilizado para imagem(Figura Suplementar 1B). Além disso, informações sobre o comprimento de onda de excitação, o fluorofofóbico e o tempo de exposição também podem ser fornecidas, mas não são críticas para uma análise mais aprofundada.
6. Uma vez que todas as imagens são carregadas, salvar a série de lapso de tempo inscrita como uma lista de filmes, selecionando o "Save As Movie List". No lado direito da janela de diálogo selecione a opção "U-Track" e pressione "Continue" (Figura Suplementar 1C).
   Nota: Os valores são otimizados para as células HeLa. Se mudar para uma linha celular diferente, os valores devem ser definidos novamente. Alternativamente, use as configurações recomendadas pelos desenvolvedores de software. A explicação detalhada de cada um dos parâmetros e como eles devem ser definidos pode ser encontrada no relatório técnico fornecido com a versão anterior do software, plusTipTracker⁵⁰.
7. A partir da janela pop-up selecionar "Microtubule Plus-Ends" e pressione "Ok" (Figura Suplementar 1C). A nova janela de diálogo permite determinar os parâmetros para as três etapas da análise(Figura Suplementar 1D),que são detecção, rastreamento e análise de rastreamento.
8. Na etapa 1 escolha "Configurações" e de um menu suspenso selecione "Detecção de cometa" como um método de detecção(Figura Suplementar 2B).
   1. A partir da nova janela de diálogo definem os parâmetros para a diferença do filtro gaussians e a segmentação da bacia hidrográfica da seguinte forma(Figura Complementar 2C):Processo de máscara a ser utilizado para a detecção = Nenhum; Desvio padrão gaussiano de passagem baixa = 1 pixel; Desvio padrão gaussiano de alta passagem = 3 pixels; Limite mínimo = 3 desvios padrão; Tamanho da etapa do ponto inicial = 0.25 desvios padrão. Selecione"Aplicar configurações para todos os filmes"e"Aplicar".
9. Na etapa 2, os parâmetros para a ligação, fechamento de lacunas, fusão e divisão, e as funções de filtro Kalman são definidos em três etapas, como destacado em rosa, verde e azul, em conformidade(Figura Suplementar 3B). Para essas etapas, selecione a "Microtubule Plus-end Dynamics" e da opção "Configuração" definem os valores indicados na Figura Suplementar 3C-E,respectivamente.
   1. Para problemas com dimensionalidade, escolha "2" do menu suspenso. Use a diferença máxima para fechar = 5 quadros; Comprimento mínimo de segmentos da trilha da primeira etapa = 3 frames. Como antes, selecione"Aplicar configurações para todos os filmes"e clique em"Aplicar".
10. Na etapa 3 da análise, as faixas de MT detectadas são classificadas(Figura Suplementar 4). Como método de análise de pista, escolha "Microtubule Dynamics Classification" e definir os parâmetros através do botão "Configuração" como indicado na Figura Suplementar 4B, C. Depois disso, escolha o"Aplicar Configurações para todos os filmes"caixa e clique em "Aplicar".
11. Uma vez que todos os parâmetros são definidos, a partir do "Painel de Controle -U-Track" janela (Figura Suplementar 1D) selecione o "Aplicar Check / Desmarcada para todos os filmes" e "Executar todos os filmes" caixas e imprensa "Run". Isso iniciará a análise mt da série time-lapse.
12. Uma vez que o processamento do filme é concluído, uma mensagem "Seu filme (s) foram processados com sucesso" é exibido. Pressione "Ok",então "Salve".
13. Agora é seguro sair do software de análise numérica. Os resultados do processamento do filme são armazenados em estruturas de subfolderas como arquivos m na pasta onde os arquivos brutos são armazenados.

5. Análise estatística da dinâmica do MT

1. Importe os arquivos m em um programa de análise estatística preferido.
   Nota: No nosso caso, primeiro importamos os arquivos em uma planilha padrão para torná-los legíveis. Os arquivos m contêm informações estatísticas (desvio mediano, médio e padrão) em diferentes parâmetros (por exemplo, velocidade de crescimento, dinâmica do MT). A lista detalhada dos parâmetros é dada no relatório técnico fornecido com a versão anterior do software, plusTipTracker^50,52. Os arquivos m gerados também podem ser importados para outros softwares de processamento de dados.
2. Escolha o parâmetro "velocidade de crescimento média" e importá-lo em uma tabela para estatísticas e exibição. Insira as informações em outros parâmetros , (por exemplo, "dinâmica") seja em uma nova tabela ou em uma nova coluna da mesma tabela e enredo agrupados.

Resultados

Seguindo o protocolo dado esboçado na figura 1A,o plasmid do pEB3-tdTomato foi expressado transitonte em pilhas assynchronously crescentes de HeLa. As células foram sincronizadas 48 h após a transfecção na prometaphase através do tratamento de DME (Figura 1B). Esta etapa garantiu que a medição da dinâmica do MT fosse feita sempre na mesma fase do ciclo da pilha. Os filmes de lapso de tempo foram processados e analisados com U-Track v2.2.0 como descrito ...

Discussão

Aqui, descrevemos uma modificação de um método estabelecido pela primeira vez por Ertych et al.⁴⁴. Junto com várias outras modificações, combinamos esta técnica de análise de dinâmica MT com imagens confocais de disco de fiação dupla. O uso do disco de fiação dupla melhora a resolução de MTs em crescimento, reduzindo a fototoxicidade^36. Reduzimos ainda mais o photobleaching e os danos induzidos pela luz laser das células, mudando para um repórter fluorescen...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software