Misurazione della microtubule Dynamics mediante microscopia disco rotante in spindle mitotici monopolari

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo robusto e dettagliato di analisi delle dinamiche dei microtubuli nelle cellule sincronizzate nella prometafase utilizzando la microscopia confocale del disco di filatura a cellule vive e l'elaborazione delle immagini basata su MATLAB.

Abstract

Descriviamo una modifica di un metodo stabilito per determinare la dinamica dei microtubuli nelle cellule viventi. Il protocollo si basa sull'espressione di un marcatore geneticamente codificato per le estremità positive dei microtubuli (EB3 etichettato con proteina fluorescente tdTomato) e dell'imaging ad alta velocità, ad alta risoluzione e a cellule vive utilizzando la microscopia confocale del disco rotante. La sincronizzazione del ciclo cellulare e l'aumento della densità dei microtubuli si ottengono inibendo la separazione centrosomica nelle cellule mitotiche e l'analisi della crescita viene eseguita utilizzando il software U-Track open-source. L'uso di una proteina fluorescente luminosa e rossa, in combinazione con la minore potenza laser e la riduzione del tempo di esposizione necessaria per la microscopia su disco rotante riduce la fototossicità e la probabilità di artefatti indotti dalla luce. Ciò consente di imaging di un maggior numero di cellule nella stessa preparazione, mantenendo le cellule in un mezzo di crescita in condizioni di coltura standard. Poiché l'analisi viene eseguita in modo automatico supervisionato, i risultati sono statisticamente robusti e riproducibili.

Introduzione

I microtubuli (MT) sono strutture altamente dinamiche che si trovano praticamente in tutte le cellule eucariotiche e in alcuni batteri¹. Insieme ad actin e filamenti intermedi, scolpiscono il citoscheletro^2,3. Divisione cellulare⁴, trasporto molecolare⁵, flagellir battendo⁶, la sensazione dell'ambiente circostante attraverso il ciglio primario⁷, udito (kinocio)^8,9, embriogenesi^10,11,12, invasione e metastasi^13,14, e anche la formazione della memoria^15,16,17,18, e molti altri processi si basano principalmente sulle MT. La partecipazione degli MT in tutti questi eventi sarebbe impossibile senza la loro notevole capacità di passare rapidamente dalla crescita (polimerizzazione) al restringimento (depolimerizzazione). Questa proprietà è descritta come instabilità dinamica¹⁹. La dinamicità MT è alterata in molte condizioni patologiche^20,21,22. Quindi, determinare la natura di questa proprietà può aiutare a comprendere i meccanismi della malattia e successivamente il loro trattamento.

È stata sviluppata una lunga lista di metodi per l'analisi delle dinamiche MT, la maggior parte dei quali si basa noto su tecniche di imaging²³. Inizialmente, sono stati utilizzati microscopi a luce a campo largo per osservare la formazione di polimeri di tubulina in vitro²⁴. La scoperta di proteine di legame finale (EB) che si raccolgono a MT plus-end e lo sviluppo di metodi per etichettare fluorescenti proteine ha permesso di osservare il comportamento delle MT direttamente nelle cellule viventi con ampi campi e microscopi a confocalizzazione della confraternita^25,26,27. Una proteina EB è la proteina di legame finale 3 (EB3)²⁸; sovraesprimendo e tracciando EB3 fuso a una proteina fluorescente, MT più tassi di assemblaggio end possono essere determinati^29,30.

La microscopia a fluorescenza a scansione laser confocale (CLSM) viene spesso utilizzata per seguire la dinamica MT. Tuttavia, questa tecnica di imaging rappresenta un alto rischio di fototossicità e fotosbiancamento, due processi indesiderati per l'imaging campione di cellule vive e dim³¹. Al fine di ottenere un migliore rapporto segnale-rumore, la potenza del laser e la durata dell'esposizione dovrebbero essere sufficientemente elevate senza danneggiare i campioni, e questo richiede di sacrificare la risoluzione in cambio di velocità. Un'alternativa adatta al CLSM è la microscopia a disco rotante³². Questa modalità di imaging si basa sull'uso di un disco Nipkow³³, che consiste in un disco in movimento recante una serie di fori, e funziona in modo equivalente a molti microscopi CLS che immaginino lo stesso campione contemporaneamente³⁴. Pertanto, la luce del laser illuminerà diverse regioni del campione contemporaneamente, ma manterrà la natura confocale. Il disco Nipkow, quindi, permette di ottenere immagini simili a CLSM ma più velocee e utilizzando meno potenza laser. Il disco Nipkow è stato ulteriormente migliorato da Yokogawa Electric, che ha introdotto un secondo disco con una serie di microlenti su di esso che dirigere individualmente la luce in un rispettivo foro stenopeico, riducendo ulteriormente la fototossicità e il fotosbiancamento³⁵. Così, la microscopia a scansione laser su disco rotante è diventata un metodo di scelta per l'imaging delle cellule vive, e permette di ottenere immagini con alto rapporto segnale-rumore ad alta velocità^31,36, che è fondamentale per risolvere segnali come quelli provenienti dalle estremità MT in rapida crescita.

Le dinamiche MT differiscono temporaneamente. Ad esempio, gli MT mitotici sono più dinamici di quelli interfase^37,38. Analogamente, sono state osservate differenze nel tasso di crescita e nel restringimento anche all'interno della stessa fase del ciclo cellulare, come la mitosi^39,40. Pertanto, per evitare la falsa raccolta dei dati, la misurazione delle dinamiche MT dovrebbe essere limitata a una stretta finestra di tempo durante il ciclo cellulare. Ad esempio, la misurazione della dinamica di MT nella prometafase può essere ottenuta trattando le cellule con dimetilnastronastron (DME), un analogo monastrolo che inibisce la cinematosina Eg5⁴¹ e impedisce la formazione del mandrino mitotico bipolare⁴². L'inibizione delle cellule alla prometafase con l'inibitore Di Eg5 DME e altri derivati monastrol non influisce sulla dinamica MT^43,44,45, che rende DME uno strumento utile per studiare la dinamica MT sia nelle cellule fisse che vive⁴⁴.

Qui combiniamo il metodo di analisi della dinamica MT nelle cellule prometafase descritto da Ertych et al.⁴⁴ con doppia imaging del disco rotante. Questo metodo consente di misurazione della dinamica MT nelle cellule prometaphase raccolte da un singolo piano focale con una maggiore frequenza di imaging, ma senza fotosbiancamento e fototossicità minima. Inoltre, come reporter fluorescente, utilizziamo proteine fluorescenti tomato (tdTomato) che hanno migliorato luminosità e fotostabilità rispetto alla proteina fluorescente verde (EGFP) ed è entusiasta di luce a bassa energia⁴⁶. Pertanto, tdTomato richiede meno potenza laser per l'eccitazione ed è meno fototossico. Complessivamente, miglioriamo ulteriormente il metodo riducendo la fototossicità e migliorando la risoluzione e post-elaborazione necessarie per l'analisi delle dinamiche MT. Inoltre, creiamo una base per le modifiche future del metodo combinandolo con altre tecniche di sincronizzazione.

Protocollo

1. Semina delle cellule HeLa

1. Preparare 2 mL di 5 soluzione fibronectina a 5 g/mL in salina tampobuffer di fosfato (PBS) e aggiungerne 450 l in ogni pozzetti di un coperchio 4 ben camerato (#1.5). Incubare lo scivolo per 15 min a 37 gradi centigradi e il 5% di CO₂.
2. Risciacquare le celle HeLa in crescita asincrona con Dulbecco's Phosped Buffered Saline (DPBS) e incubare con trypsin-EDTA (0,05%: 0,02%; w:v) per 5 min a 37 . Fermare la reazione enzimatica con l'aggiunta del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio integrato con 10% di siero di vitello fetale inattivato dal calore (FCS) a 3:1 (v:v) rapporto di tripsina-EDTA aggiunto.
   NOT: Le cellule HeLa sono state mantenute in RPMI 1640 medio integrato con 10% di fSIattiva di calore a 37 e 5% di CO₂ e sono state regolarmente passaggiate una volta raggiunto l'80-90% di confluenza come descritto sopra.
3. Determinare la concentrazione cellulare utilizzando una camera Neubauer. Mescolare un'aliquota di 50 l'uno con il rapporto trypan blue a 1:1 (v:v) ( Contare solo le celle trypan blu-negative all'interno dei quattro quadrati grandi (per i dettagli vedere Phelan et al.⁴⁷). Derivare la concentrazione di cella dal numero di cella conteggiato utilizzando la seguente formula:
   
4. Pellet le cellule per centrifugazione a 300 x g per 2 min. Risospendere con RPMI 1640 fresco al fine di ottenere 1 x 10⁶ cellule / mL.
5. Rimuovere la fibronectina dallo scivolo ricucibile, lavare i pozzetti due volte con DPBS e semire50.000 cellule per pozzo.
6. Riportare l'incubatura con le cellule all'incubatrice e farle crescere per 24 h a 37 e 5% di CO₂.

2. Espressione di pEB3-tdTomato nelle cellule HeLa

1. Preparare un tubo di microcentrifuga da 1,5 ml. Per ogni tubo, diluire 2 g di pEB3-tdTomato⁴⁸ con tampone di trasfezione (prodotto sintetico in soluzione acquosa) ad un volume finale di 396 gradi centigradi.
2. Aggiungere 4 -L di reagente di trasfezione (non lipidico, contenente polietilenimine) al primo tubo e vorticare immediatamente la miscela per esattamente 10 s.
3. Ruotare brevemente il tubo con una microcentrifuga e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10 min.
4. Rimuovere le cellule HeLa dall'incubatrice. A goccia, aggiungere 100 l' l della miscela di trasfezione ad ogni pozzetto di un 4 vetrino ben camerato, e riportare le cellule all'incubatrice.
5. Dopo 4 h di incubazione a 37 e 5% di CO₂, integrare le cellule con mezzo di crescita fresco e incubare per almeno 24 h a 37 e 5% CO₂.
   NOT: È necessario ottimizzare le condizioni di trasfezione per ogni tipo di cellula. I livelli di espressione devono essere sufficientemente bassi da consentire l'identificazione di singole estremità di crescita MT. In alternativa, negli esperimenti è possibile utilizzare una linea cellulare che esprime stabilmente EB3-tdTomato; ciò ridurrebbe la variabilità nei livelli di espressione di EB3-tdTomato tra i preparati e tra le cellule della stessa preparazione⁴⁹.

3. Sincronizzazione e imaging a celle vive di cellule heLa che esprimono pEB3

1. Preparare una soluzione di 2,5 M di dimetililnastron (DME) in privo di fenolo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) completata con 10% FCS e 2 mM di glutammina o una fornitura alternativa di glutammina.
2. Sostituire il mezzo di crescita nel coperchio camerato con 500 -L del mezzo di crescita contenente 2,5 M DME e incubare le cellule a 37 e 5% di CO₂.
3. Dopo 3,5 h di incubazione con DME, trasferire le cellule al microscopio, montare lo scivolo camerato in una camera ambientale con pannelli scuri per l'imaging a 37 e 5% di CO₂e incubare ulteriormente fino a quando il tempo totale di incubazione è di 4 h.
   NOT: Il mantenimento della temperatura a 37 gradi centigradi senza fluttuazioni è fondamentale per l'esperimento.
4. Eseguire l'imaging time-lapse su un microscopio invertito dotato di un obiettivo di immersione dell'olio 1.49 N.A.100x, un sistema confocale a doppio disco rotante e un sistema di messa a fuoco automatica affidabile per la manutenzione continua del piano focale. Definire i parametri di imaging come indicato di seguito.
   NOT: Usiamo una fotocamera elettronica moltiplicante (EM-CCD).
   1. Per l'eccitazione EB3-tdTomato, utilizzare una linea laser da 561 nm con tempi di esposizione di 200 ms. Raccogliere la luce emessa attraverso un quadruplo passa banda (405, 488, 561, 640 nm) specchio dicroico e un filtro di emissione 600/52 nm.
      NOT: La potenza del laser può essere regolata per ogni cella immagine per evitare la saturazione dell'immagine. In tutti i film time-lapse dati qui la potenza laser è stata impostata a 5,3 mW.
   2. Trovare una cella nella profase e mettere a fuoco nel piano z corrispondente al centro del mandrino mitotico monopolare. Acquisire immagini ogni 0,5 s su un totale di 1 min senza binning e senza illuminazione tra le esposizioni.

4. Analisi delle dinamiche MT utilizzando U-Track v2.2.0

1. Per analizzare la dinamica MT è necessario un software di ambiente di elaborazione numerico (ad esempio, MATLAB).
   NOT: La comprensione di base del software è sufficiente per l'analisi. Il materiale di aiuto completo e le esercitazioni sono disponibili sul sito Web dello sviluppatore (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
2. Scaricare (https://github.com/DanuserLab/u-track) e installare il software open-source U-Track v2.2.0 seguendo le istruzioni dettagliate fornite nel file "Readme_u-track.pdf"^50,51,52.
3. Avviare il software di analisi numerica e aggiungere la cartella U-Track v2.2.0 con sottocartelle nel percorso di ricerca del software.
4. Dalla finestra di comando chiamare "movieSelectorGUI". Si apre una finestra di dialogo da cui è possibile importare i file non elaborati generati dal software di acquisizione delle immagini al microscopio (Figura supplementare 1, Figura 2, Figura 3, Figura 4).
   NOT: Il software U-Track è compatibile con altri formati di dati immagine. Utilizza Bio-Formati, che riconosce diversi formati di dati di life science^{53 .}
5. Le dimensioni di ogni immagine vengono lette automaticamente dai metadati. Immettere manualmente l'apertura numerica dell'obiettivo (in questo caso 1,49) e l'intervallo di tempo (0,5 s) utilizzato per l'imaging (Figura supplementare 1B). Inoltre, possono essere fornite informazioni sulla lunghezza d'onda dell'eccitazione, sul fluoroforo e sul tempo di esposizione, ma non sono fondamentali per ulteriori analisi.
6. Una volta caricate tutte le immagini, salvare la serie time-lapse inserita come elenco di film selezionando l'"elenco " Salva come filmato". Sul lato destro della finestra di dialogo selezionare l'opzione "U-Track" e premere "Continua" (Figura supplementare 1C).
   NOT: I valori sono ottimizzati per le celle HeLa. Se si passa a una linea di celle diversa, i valori devono essere definiti di nuovo. In alternativa, utilizzare le impostazioni consigliate dagli sviluppatori di software. La spiegazione dettagliata di ciascuno dei parametri e come dovrebbero essere definiti può essere trovata nella relazione tecnica fornita con la versione precedente del software, plusTipTracker⁵⁰.
7. Dalla finestra pop-up selezionare "Microtubule Plus-Ends" e premere "Ok" (Figura supplementare 1C). La nuova finestra di dialogo consente di determinare i parametri per i tre passaggi dell'analisi (Supplementary Figure 1D), che sono il rilevamento, il rilevamento e l'analisi del tracciato.
8. Nel passaggio 1 scegliere "Impostazioni" e da un menu a discesa selezionare "Rilevamento cometa" come metodo di rilevamento (Figura supplementare 2B).
   1. Dalla nuova finestra di dialogo definire i parametri per la differenza del filtro gaussiani e la segmentazione spartiacque come segue (Supplementary Figure 2C): Processo di maschera da utilizzare per il rilevamento - Nessuno; Deviazione standard gaussiana a passate basse: 1 pixel; Deviazione standard gaussiana ad alto passaggio : 3 pixel; Soglia minima: 3 deviazioni standard; Dimensione del gradino della soglia: 0,25 deviazioni standard. Selezionare "Applica impostazioni a tutti i filmati" e "Applica".
9. Nel passaggio 2, i parametri per il collegamento, la chiusura dello spazio, l'unione e la divisione e le funzioni di filtro Kalman sono definiti in tre passaggi come evidenziato in rosa, verde e blu, di conseguenza (Figura supplementare 3B). Per questi passaggi, selezionare "Microtubule Plus-end Dynamics" e dall'opzione "Impostazione" definire i valori indicati rispettivamente nella figura supplementare 3C-E.
   1. Per i problemi di dimensionalità, scegliere "2" dal menu a discesa. Utilizzare Il divario massimo per chiudere 5 fotogrammi; Lunghezza minima dei segmenti di traccia dal primo passaggio : 3 fotogrammi. Come prima, selezionare "Applica impostazioni a tutti i film" e fare clic su "Applica".
10. Nel passaggio 3 dell'analisi, le tracce MT rilevate sono classificate (Figura supplementare 4). Come metodo di analisi della traccia, scegliere "Microtubule Dynamics Classification" e definire i parametri tramite il pulsante "Impostazione" come indicato nella Figura supplementare 4B,C. Dopo di che, scegliere la "Applica impostazioni a tutti i film" casella e fare clic su "Applica".
11. Una volta definiti tutti i parametri, dalla finestra " Pannello dicontrollo–U-Track" (Figura supplementare 1D) selezionare le caselle "Applica controllo/Deseleziona a tutti i film" e " Esegui tutti ifilm" e premere "Esegui". In questo modo verrà avviata l'analisi MT della serie time-lapse.
12. Una volta completata l'elaborazione del filmato, viene visualizzato il messaggio "I film sono stati elaborati correttamente". Premere "Ok", quindi"Salva".
13. Ora è sicuro di uscire dal software di analisi numerica. I risultati dell'elaborazione del filmato vengono memorizzati in strutture di sottocartelle come file m nella cartella in cui sono archiviati i file non elaborati.

5. Analisi statistica della MT Dynamics

1. Importare i file m in un programma di analisi statistica preferito.
   NOT: Nel nostro caso, importiamo prima i file in un foglio di calcolo standard per renderli leggibili. I file m contengono informazioni statistiche (mediana, media e deviazione standard) su diversi parametri (ad esempio, velocità di crescita, dinamicità MT). L'elenco dettagliato dei parametri è riportato nella relazione tecnica fornita con la versione precedente del software, plusTipTracker^50,52. I file m generati possono anche essere importati in altri software di elaborazione dati.
2. Scegliere il parametro "media velocità di crescita" e importarlo in una tabella per le statistiche e la visualizzazione. Immettere le informazioni su altri parametri (ad esempio, "dynamicity") in una nuova tabella o in una nuova colonna della stessa tabella raggruppata e del grafico.

Risultati

Seguendo il protocollo descritto nella figura 1A, il plasmidp pEB3-tdTomato è stato espresso in modo temporaneo in celle HeLa in crescita asincrona. Le cellule sono state sincronizzate 48 h dopo la trasfezione a prometafase attraverso il trattamento DME(Figura 1B). Questo passaggio ha assicurato che la misurazione della dinamica MT è sempre stata eseguita nella stessa fase del ciclo cellulare. I filmati time-lapse sono stati ulteriormente elaborati e analizzat...

Discussione

Qui, descriviamo una modifica di un metodo stabilito per la prima volta da Ertych et al.⁴⁴. Insieme a diverse altre modifiche, combiniamo questa tecnica di analisi della dinamica MT con l'imaging confocale a doppio disco rotante. L'uso del doppio disco rotante migliora la risoluzione delle MT in crescita riducendo la fototossicità³⁶. Riduciamo ulteriormente il fotosbiancamento e i danni indotti dalla luce laser delle cellule passando a un reporter fluorescente a lunghezza ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dimethylenastron	Merck	324622
DMEM w/o phenol red	Gibco	31053-28
DPBS	Gibco	14190-094
Fetal bovine serum	Biochrom	S0415
Fibronectin Bovine Plasma	Merck	F4759	Sterile powder
GlutaMAX	Gibco	35050-038	Stable glutamine substitutive
jetPRIME	Polyplus	114-15
EB3-TdTomato	Addgene	plasmid #50708
RPMI 1640	Gibco	61870-010
Trypan Blue	Merck	T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution	Biochrom	L2143	0.05% / o.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide	Ibidi	80426	4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope	Nikon	NA
Objective	Nikon	MRD01991	CFI Apo TIRF 100XC Oil
ACAL Laser Excahnger	Nikon		Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647nm
Spinning disk module	Andor	CSU-W
Camera	Andor	iXon Ultra 888
Environmental Chamber	Okolab		Dark chamber equipped with CO2 supply, tmeperature control and humidifier
HeLa Cells	DSMZ	ACC-57
NIS Elements v4	Nikon		Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB	Mathworks		Computing environment
Prism 8	GraphPad		Statistical analysis and display software