Aqui demonstramos como criar o Tetra Astyanax Mexicanus mexicano, criar as larvas e realizar imunohistoquímica de monte inteiro em peixes pós larvais para comparar os fenótipos de peixes adaptados ao rio e às cavernas. Criamos o peixe com a mesma densidade em uma dieta rica em nutrientes de rotifers. Essa técnica garante um crescimento consistente e proporciona vantagens em custo, biossegurança e qualidade da água.
Para começar, coloque uma malha de plástico no fundo de um tanque de cinco galões. Em seguida, encha o tanque com água pronta para peixes. Fixar um aquecedor de água na lateral do tanque.
Adicione uma fêmea e dois peixes machos Astyanax Mexicanus que têm mais de um ano de idade ao tanque. Coloque a temperatura do aquecedor de água para 24 graus Celsius. Depois de 24 horas, aumente a temperatura em um grau Celsius.
Brilhe uma lanterna no fundo do tanque todos os dias para verificar se há ovos. Uma vez identificados os ovos no tanque de reprodução, remova o peixe adulto e a malha plástica. Use um béquer para reduzir a profundidade da água para 10 cm.
Para estimar o tempo da fertilização, use uma pipeta de transferência para colocar vários ovos em uma placa de petri e visualizá-los com um microscópio estéreo para determinar seu estágio. Remova ovos ou fezes opacas. Em seguida, encha o tanque com água pronta para peixes e adicione sete gotas de azul metileno à água.
Depois disso, adicione um aquecedor e um borbulhador de aquário ao tanque. Ajuste o aquecedor a 24 graus Celsius e ajuste o regulador de fluxo de ar para produzir um fluxo suave de bolhas. Em seguida, cubra o tanque para manter a temperatura da água.
Adicione 20 gramas de sal a oito litros de água pronta para peixes e mexa até dissolver. Em seguida, adicione um litro de água preparada a cada recipiente de berçário. Em seguida, use uma pipeta de transferência para mover 20 larvas eclodidas para cada recipiente de berçário.
Agitar a água no tanque maior para garantir que todas as larvas tenham sido removidas. Para preparar o alimento do peixe, adicione três ml de mistura de algas a um litro de rotifers colhidos. Cinco dias após a fertilização adicionam três ml de alimento de peixe a cada recipiente de berçário.
Os rotifers devem ser visíveis em grupos densos no canto dos recipientes, a menos que visíveis perto do centro. Verifique o recipiente para rotifers todos os dias e adicione mais alimentos se a concentração estiver esgotada. Remova qualquer larva morta.
Primeiro, para limpar o trato gastrointestinal do conteúdo alimentar, despeje o recipiente do berçário com o peixe da idade desejada através de um filtro de malha de nylon. Coloque o coador em um recipiente com água pronta para peixes limpos e retenha alimentos por 24 horas. Após eutanásia do peixe, de acordo com as diretrizes institucionais, use uma pipeta de transferência para transferir o peixe para um tubo cônico.
Substitua a solução de eutanásia por fixação. E incubar o tubo com balanço durante a noite a 4 graus Celsius. Depois disso, remova o fixador e substitua-o por PBST.
Incubar o tubo por mais 15 minutos com balanço. E repita o processo de lavagem mais uma vez. Em seguida, use uma pipeta de transferência para mover o peixe para um frasco de vidro de quatro ml com uma tampa superior do parafuso.
Remova o PBST do frasco e adicione três ml de solução de bloqueio. Incubar o frasco à temperatura ambiente por uma hora com balanço. Depois disso, use uma pipeta de transferência para remover a solução de bloqueio e substituí-la por anticorpo primário diluído na solução de bloqueio.
Incubar o frasco durante a noite à temperatura ambiente com agitação. Em seguida, lave o peixe com PBST três vezes, como descrito anteriormente. Substitua o PBST por anticorpo secundário diluído na solução de bloqueio.
E incubar o frasco durante a noite à temperatura ambiente com agitação. Por fim, lave o peixe três vezes por 15 minutos com PBST. Usando este protocolo, os peixes da superfície Tinaja, Molino e Pachon foram criados em tanques estáticos de reprodução.
A superfície e pachon desova, com embriões fertilizados, sempre produziram larvas eclodidas. Enquanto os Molino e Tinaja não tiveram sucesso algumas vezes. Em geral, os peixes superficiais produziram o maior número de larvas por desova, seguidos por Pachon, Tinaja e Molino, respectivamente.
A técnica de imunostaining de montagem inteira foi usada com sucesso para rotular neurônios e células pancreáticas em estágios até 12,5 dias após a fertilização. É importante remover qualquer peixe morto enquanto você levanta as larvas e registra o número de peixes sobreviventes. Se muitos peixes morrem, pode ser devido à contaminação bacteriana ou fúngica.
Os tanques devem ser esterilizados com 70% de etanol antes do uso. A técnica de imunossustaining que descrevemos tem sido usada com sucesso para os anticorpos listados na tabela de materiais. Após a imunossuagem, os peixes podem ser montados inteiros ou seccionados para ver qualquer tecido de interesse.
Em combinação, o procedimento de reprodução, incubação e imunossamento fornecem um método robusto para avaliar a atividade genética NC2 de forma comparável entre laboratórios.
