ここでは、メキシコのテトラ・アスティアナックス・メキシカーヌスを飼育し、幼虫を育て、幼虫後の魚に全型免疫組織化学を行い、川と洞窟適応魚の表現型を比較する方法を示します。私たちは、ロチファーの栄養豊富な食事に同じ密度で魚を育てます。この技術は一貫した成長を保障し、費用、バイオセキュリティおよび水質の利点を提供する。
まず、5 ガロンタンクの底にプラスチックメッシュを配置します。その後、魚の準備水でタンクを埋めます。タンクの側面に給湯器を貼ります。
1歳以上の雌と2匹のオスのアスティアナックス・メキシカンス魚をタンクに加えます。給湯器の温度を摂氏24度に設定します。24時間後、温度を1度上げます。
卵をチェックするために毎日タンクの底に懐中電灯を照らします。繁殖タンクで卵が特定されたら、成魚とプラスチックメッシュを取り除きます。ビーカーを使用して水深を10cmに減らします。
受精時間を推定するには、トランスファーピペットを使用していくつかの卵をシャーレに入れ、ステレオ顕微鏡で見てステージを決定します。不透明な卵や便を取り除きます。その後、魚の準備水でタンクを満たし、水にメチレンブルーの7滴を追加します。
この後、タンクにヒーターとアクアリウムバブラーを追加します。ヒーターを摂氏24度に設定し、気泡の穏やかな流れを作り出すために気流レギュレータを調整します。その後、水温を維持するためにタンクをカバーします。
魚の準備水の8リットルに塩20グラムを加え、溶けるまでかき混ぜます。次に、各託児容器に1リットルの水を加えます。次に、移管ピペットを使用して、孵化した幼虫の20を各保育園の容器に移動させます。
大きなタンクの水を攪拌して、すべての幼虫が取り除かれていることを確認します。魚の食べ物を準備するには、収穫されたロティファーの1リットルに藻類混合物の3 mlを追加します。受精後5日間で、各保育園の容器に3mlの魚の食べ物を加えます。
ロティファーは、中央付近に表示されない限り、コンテナの隅に密集したグループで表示される必要があります。毎日のローティファーの容器をチェックし、濃度が枯渇した場合は、より多くの食品を追加します。死んだ幼虫を取り除く。
まず、食品内容物の消化管をクリアし、ナイロンメッシュストレーナーを介して所望の年齢の魚と共に保育園の容器を注ぐ。きれいな魚の準備水で容器にストレーナーを置き、24時間食べ物を差し控えます。魚を安楽死させた後、制度的ガイドラインに従って、魚を円錐管に移すために移管を使用する。
安楽死溶液を固定液に置き換えます。そして、摂氏4度で一晩揺れるチューブをインキュベートします。この後、固定剤を取り除き、PBSTに置き換えます。
さらに15分間、ロッキングでチューブをインキュベートします。そして、もう一度洗浄プロセスを繰り返します。次に、転送ピペットを使用して、スクリュートップキャップ付きの4mlガラスバイアルに魚を移動させます。
バイアルからPBSTを取り出し、3mlのブロッキング溶液を加えます。ロッキングで1時間室温でバイアルをインキュベートします。この後、ブロック溶液を除去するために移管ピペットを使用し、ブロッキング溶液中で希釈された一次抗体と交換してください。
攪拌で室温で一晩バイアルをインキュベートします。次に、先に述べたように、PBSTで魚を3回洗う。PBSTをブロッキング溶液で希釈した二次抗体に置き換えます。
そして、攪拌で室温で一晩バイアルをインキュベートします。最後に、PBSTで15分間魚を3回洗います。このプロトコルを使用して、表面魚ティナジャ、モリーノとパチョン洞窟魚は、静的繁殖タンクで飼育されました。
表面とパチョンスポーンは、受精胚で、常に孵化した幼虫を産生した。モリーノとティナジャは失敗したが、時間の一部。一般に、表面魚は産卵あたり最も多くの幼虫を生産し、次いでパション、ティナジャ、モリーノが続いた。
全型免疫染色技術は、受精後12.5日までの段階でニューロンおよび膵臓細胞に標識するのに成功した。幼虫を上げ、生き残った魚の数を記録する際に、死んだ魚を取り除く必要があります。多くの魚が死ぬ場合は、細菌や真菌の汚染が原因である可能性があります。
タンクは、使用前に70%エタノールで滅菌する必要があります。我々が述べた免疫染色技術は、材料表に記載されている抗体に対して正常に使用されている。免疫染色後、魚は、目的の任意の組織を見るために全体を取り付けたり、切除することができます。
組み合わせて、飼育、孵化および免疫染色手順は、実験室間で同等の方法で遺伝子活性NC2を評価するための堅牢な方法を提供する。
